论文部分内容阅读
细胞外基质硬度通过调控细胞的粘附、增殖、迁移进而对细胞的分化产生重要影响。不同的基质硬度可使骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)分别向神经细胞、脂肪细胞、肌细胞和成骨细胞方向分化。然而,细胞外的物理信号如何转译成细胞内信号调控干细胞分化的分子机制所知甚少。本研究基于基质硬度诱导BM-MSCs成骨分化的基础上,应用动态力学反应仪检测构建的基质凝胶硬度,RT-qPCR检测实验过程中基因水平的变化,Western Blot检测蛋白水平的变化以及iTRAQ技术筛选蛋白组学水平的差异蛋白。重点探索硬基质诱导BM-MSCs成骨分化早期蛋白质组学的变化,旨在从蛋白水平研究基质硬度调控BM-MSCs成骨分化的分子机制。所得结果如下:(一)成功构建了不同硬度的基质凝胶(13-16 kPa,35-38 kPa,48-53 kPa和62-68 kPa)。构建的基质凝胶经肉眼观测,发现随着基质硬度的增高,颜色逐渐由透明变为不透明;扫描电镜观察,凝胶表面平坦光滑但能够看到纳米级孔隙,并且随着基质硬度的增加孔隙逐渐增大。当凝胶表面均匀铺有2ug/cm~2纤连蛋白时,经肉眼观测凝胶表面依旧平坦光滑,但电子显微镜显示纤连蛋白能够覆盖凝胶表面纳米级孔隙。此时的凝胶使细胞粘附和铺展。虽然聚丙烯酰胺凝胶已经被证实为无毒材料,但是制备过程中未结合的游离丙烯酰胺单体对细胞增殖有抑制作用。因此分别在第24,48及72h提取四种硬度的凝胶浸提液分别培养hBM-MSCs 72h后,以普通培养液培养的细胞作为对照组,用CCK8检测细胞活性,发现用浸提液培养的细胞活性与对照组相比并无显著差异。说明凝胶中的丙烯酰胺单体含量微弱,不足以降低细胞的增殖活性,能够用于后续实验研究。(二)将分离提取的小鼠BM-MSCs进行分离培养鉴定。在不同硬度的凝胶上,细胞的形态发生了类似于神经、肌、成骨细胞的形态。并且随着基质硬度增高,细胞的粘附能力和增殖能力逐渐增高。检测自我更新能力标记物Sox2和Oct4的表达,结果发现,在培养4小时至1周内,Sox2在13-16 kPa和62-68 kPa上表达较低,而在48-53 kPa上表达较高。在培养的第4小时,Oct4在13-16 kPa上表达显著高于48-53kPa,而在其它时间点,各组之间均无显著差异。说明在48-53 kPa上,细胞的自我更新能力最强。培养1周之后,检测成骨细胞标记物RUNX2、Osteocalcin、Osteopontin、ALP和一型胶原蛋白(alpha-1 type I collagen,COL1A1),结果发现RUNX2、Osteopontin和ALP在62-68 kpa的硬度上高表达,提示细胞向成骨细胞方向分化。上述实验说明基质硬度能够调控小鼠BM-MSCs的形态、粘附、增殖和成骨分化行为。(三)62-68 kPa不仅能够调控BM-MSCs高表达成骨细胞标记物,还诱导该细胞出现钙结节和ALP棕色片状沉积,进一步证实基质硬度诱导BM-MSCs进行成骨分化。在此分化过程中,用i TRAQ技术检测62-68 kPa上培养的细胞中的蛋白质,结果发现上调的差异蛋白多参与细胞内调控,尤其是细胞与细胞之间的粘附作用,并且与整合素的结合相关。经过实验证实整合素α5在mRNA和蛋白水平表达均显著增高,且下游信号分子FAK、p-ERK、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β及β-catenin在62-68 kPa上表达量亦明显增多,提示62-68 kPa能够通过活化Akt,抑制GSK-3β活性将信号分子下传。当封闭整合素α5之后,成骨细胞标记物RUNX2、COL1A1和Osteocalcin的表达显著降低,BM-MSCs的成骨分化受到了抑制。但是Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的蛋白表达增高,说明在此过程中,上述蛋白参与了负性调节作用。当抑制Akt之后,p-GSK-3β的表达含量明显下降,说明在62-68 kpa的ECM上,GSK-3β是由Akt来调控的。上述实验说明在62-68 kPa诱导BM-MSCs成骨分化过程中,整合素α5/PI3K和Wnt/β-catenin发挥了调控作用。综上所述,本研究构建了四种不同硬度的基质,能够调控BM-MSCs生物学行为,为后续基质硬度调控干细胞分化研究奠定了基础。高硬度的基质不仅能够调控骨髓间充质干细胞的自我更新能力,还能够诱导细胞进行成骨分化。在分化过程中,整合素α5/PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路发挥重要的调节作用。对进一步揭示基质硬度诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的机制具有重要意义。