随着养猪业迅速发展,粪尿中大量氮磷对环境的影响日益严重。虽然饲料添加酶制剂能有效降低氮磷排放量,但是饲料高温高压等加工工艺和贮存条件导致酶的损失率高且效果不稳定。目前使用的酶制剂主要包括非淀粉多糖(non-starch polysaccharide,NSP)酶和植酸酶等。环保型转基因猪中NSP酶和植酸酶以内源酶的形式持续而稳定发挥作用,不仅避免饲料加工工艺影响,还能降低酶制剂和无机磷等使用量,对降低饲料成本和缓解氮磷对环境的负面影响具有重要意义。本研究利用2A多肽构建一条包含4个酶基因的具有自我剪切能力和独立表达能力的多顺反子PXAT,这4个酶基因包括PG7fn(果胶酶基因)、XynB(木聚糖酶基因)、EsAPPA(植酸酶基因)和TeEGI(纤维素酶和β-葡聚糖酶基因。通过比较转染效率可知,Nucleofector 2b的U-023为大载体转染猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的理想条件,并在此条件下转染PXAT获得piggyBac转座子介导的转基因细胞,然后在环化重组(cyclization recombination,Cre)酶的作用下删除荧光标记基因,最后运用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)成功制备无荧光标记基因的转PXAT基因猪。在DNA分子水平检测结果显示4个酶基因已整合至920001、920005、和920307三头克隆猪的基因组中,且均为双拷贝。而4个基因的mRNA在三大唾液腺表达水平较高,特别是腮腺。但是Western blot只检测到XynB和EsAPPA蛋白特异性条带,唾液样品也只有明显的XynB木聚糖酶和EsAPPA植酸酶的酶活,分别为0.07U/mL~0.43 U/mL和0.43 U/mL~3.40 U/mL。本研究利用piggyBac系统将20 kb以上的大载体随机整合至PFFs,成功获得共表达多个酶的转PXAT基因猪,对制备整合大片段的环保型转基因猪具有参考意义。