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肺动脉高压(PAH)是肺血管阻力进行性增加,肺动脉压力持续增高,影响心肺功能和心输出量,引起活动受限和寿命缩短的病理综合征。目前的特异性靶向药物治疗能改善病情,但作用有限。内皮祖细胞(EPCs)联合基因治疗是未来的新方向。EPCs具有归巢至血管损伤部位,分化为成熟内皮细胞,形成血管等生物特性,同时也是具有促进EPCs生理功能,表达有功能蛋白的基因的载体。二者共同作用以达到改善血管重塑的目的。本文以众多的基因修饰EPCs的治疗为参考,在野百合碱(MCT)诱导的大鼠PAH模型中研究预防性静脉注射人组织激肽释放酶1(hTK1)基因转染的同源EPCs对PAH的血流动力学、病理改变的影响。从而为PAH的细胞生物学治疗提供一些科学依据。研究目的观察静脉注射转染人组织激肽释放酶(hTK1)基因的同源内皮祖细胞(EPCs)对野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺动脉高压(PAH)血流动力学,血清一氧化氮(NO)水平和肺小动脉病理改变的影响。研究方法1、细胞实验:(1)密度梯度离心法分离提取雄性Wistar大鼠骨髓单个核细胞,EGM-2完全培养基培养;(2)通过观察细胞生长特性,吞噬红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)及结合异硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)的荧光检测,鉴定骨髓源性单个核细胞(BMMNCs)为EPCs;(3)携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)梯度转染EPCs,观察细胞生长活性和荧光显示情况,获得该腺病毒对EPCs的最佳转染复数(MOI);(4)CCK8细胞增殖实验和划痕愈合实验观察携带hTK1基因的腺病毒(Ad-hTK1)转染对EPCs增殖、迁移能力的影响;(5)检测Ad-hTK1转染EPCs细胞裂解液中一氧化氮(NO)含量;(6)Western blotting检测Ad-hTK1转染EPCs中人组织激肽释放酶(hTK1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达情况。2、动物实验:(1)7-8周雄性Wistar大鼠30只随机分为正常对照组6只(NC组),和1%MCT溶液腹腔注射建立的PAH模型组。模型组再随机分为3组,每组8只,于MCT注射3天后分别颈静脉注射磷酸盐缓冲液(MCT+PBS组)、同源EPCs(MCT+EPCs组)或转染hTK1基因的EPCs(MCT+Ad-hTK1-EPCs组),注射细胞数量约为106/次(以0.5ml PBS混匀),连续注射两天;(2)实验前和造模2周、4周对四个动物组进行心脏超声检查,动态监测的超声参数包括右室前壁厚度(RVAWT)、肺动脉内径(PAD)、主动脉内径(AOD)、肺、主动脉内径之比(PAD/AOD)、肺动脉加速时间(PAAT)、肺动脉射血时间(PAET)、肺动脉加速、射血时间之比(PAAT/PAET)、右室舒张末横径(RVEDD)、右室舒张末纵径(RVEDL)、右室舒张末横径、纵径之比(RVEDD/RVEDL)、三尖瓣环收缩期位移(TAPSE)、左室射血分数(LVEF);(3)检测实验前和造模2周、4周四个组血清NO水平;(4)最后一次心脏超声检查后,右室置管测肺动脉压,记录肺动脉收缩压(PASP)、肺动脉平均压(PAMP)、右室压力上升速率dp/dtmax和下降速率dp/dtmin;(5)右室测压后取材心肺器官,测量右心室肥厚指数(RVHI),肺组织石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色测量血管外径100-200μm的肺小动脉管壁厚度指数(WT%)、管壁面积指数(WA%);(6)Western blotting检测肺组织hTK1、eNOS蛋白表达情况;(7)Ad-GFP-EPCs静脉移植入MCT腹腔注射7天后的两只大鼠体内,2天后取材,冰冻切片观察EPCs在心、肝、脾、肺、肾中分布情况。研究结果:1、细胞实验结果:(1)骨髓单个核细胞经培养和诱导分化,原代细胞4天贴壁,7天出现细胞集落,14-21天可传代,传代细胞仍可见细胞集落,3-7天传代一次,随着传代次数增加,集落变小,逐渐消失,细胞增殖分化类似内皮细胞;(2)Dil-acLDL、FITC-UEA-I双阳性染色鉴定BMMNCs为正在分化的EPCs;(3)按MOI=0,25,50,100,150,200,250将Ad-GFP转染入EPCs,在MOI=150时细胞荧光显示最好,且细胞生长活性不受影响,因而确定最佳MOI=150;(4)CCK8细胞增殖实验和划痕愈合实验结果分别显示Ad-hTK1转染EPCs(Ad-hTK1-EPCs)的吸光度值A450、划痕48小时后愈合面积均大于未转染EPCs(EPCs)和转染了对照病毒Ad-GFP 的EPCs(Ad-GFP-EPCs),提示Ad-hTK1转染增强了细胞的增殖活性和迁移能力(P<0.05);(5)Ad-hTK1-EPCs细胞裂解液中NO含量高于EPCs和Ad-GFP-EPCs(P<0.05);(6)Ad-hTK1-EPCs稳定表达hTK1蛋白,eNOS蛋白表达水平高于EPCs和Ad-GFP-EPCs(P<0.05)。2、动物实验结果:(1)与NC组比较,模型组大鼠一般状况较差,存活数减少,造模2周、4周的体重增加减少。其中2周时体重增加数值比较,MCT+PBS组、MCT+EPCs组和NC组间差异有统计学意义(P<0.05),MCT+PBS组和MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P<0.05);(2)四个动物组超声心动图参数比较,随着时间延长,PAH模型组特别是MCT+PBS组、MCT+EPCs组的RVAWT、PAD/AOD、RVEDD/RVEDL测算值逐渐增大,PAAT、PAAT/PAET、TAPSE测算值逐渐减小。MCT+PBS组PAD/AOD、PAAT、PAAT/PAET、RVEDD/RVEDL的测算值与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P<0.05);MCT+EPCs组的PAAT、PAAT/PAET测算值与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P<0.05);(3)四组动物实验前,造模2周、4周血清NO变化情况为MCT+Ad-hTK1-EPCs组血清NO含量持续增高,与其他3组间差异有统计学意义(P<0.05);MCT+PBS组血清NO含量持续降低,2周时测值和其他3组间差异有统计学意义(P<0.05),4周时与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P<0.05);MCT+EPCs组血清NO含量2周时升高,高于NC组和MCT+PBS组,低于MCT+Ad-hTK1-EPCs组(P<0.05),4周时降低,与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有统计学意义(P<0.05);NC组血清NO含量4周时增高但低于MCT+Ad-hTK1-EPCs组(P<0.05);(4)右室测压显示模型组PASP、PAMP和dp/dtmax、dp/dtmin升高,MCT+PBS 组的 PASP、PAMP 和 dp/dtmax、dp/dtmin 测值与 NC 组和MCT+Ad-hTK1-EPCs组测值间差异有统计学意义(P<0.05),MCT+EPCs组的PASP、dp/dtmax测值与NC组测值间差异有统计学意义(P<0.05);(5)模型组RVHI增大,肺小动脉WT%和WA%增大,MCT+PBS组改变明显,与NC组、MCT+Ad-hTK1-EPCs组间差异有或近似有统计学意义(P<0.05,P≈0.05);(6)四组动物肺组织蛋白表达情况显示MCT+Ad-hTK1-EPCs组表达hTK1、eNOS蛋白;(7)Ad-GFP-EPCs的绿色荧光在大鼠心、肝、脾、肺、肾中都可见,心脏分布较少,并且主要分布在各器官的血管壁、血窦等部位。结论和意义:hTK1基因修饰EPCs增殖活性和迁移能力增强,Ad-hTK1-EPCs稳定表达hTK1、eNOS蛋白和释放NO产物;静脉移植Ad-hTK1-EPCs改善MCT诱导的大鼠PAH血流动力学和病理改变,与预防性干预策略在PAH发生早期提高了血清NO含量可能有关。