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为了研制产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)基因工程疫苗，根据已发表的K<,88>ac和LT<,B>基因序列，分别设计并合成一对K<,88>ac引物和一对LT<,B>引物，利用PCR技术，从大肠杆菌C<,83902>中扩增出K<,88>ac基因和LTB基因，将扩增的DNA片段进行分离、纯化、限制性内切酶酶切、T<,4>DNA连接酶连接，获得重组质粒pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88>ac-LT<,B>，并转化入XLl-Blue宿主菌，构建含有K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合基因表达载体的重组菌株XL1-Blue(pQE30-K<,88>ac)和XLl-Blue(pQE30-K<,88>ac-LT<,B>)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88>ac-LT<,B>中含有K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合基因，且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株XLl-Blue(pQE30.K88ac)和XLl-Blue(pQE30-K<,88>ac-LT<,B>)分别按1％的量接种到含有Amp(60μtg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养2h，然后用1mmol·L IPTG诱导6h，融合蛋白K<,88>ac和K<,88>aC-LT<,B>获得高效表达。经Western blot检测，重组菌株表达的融合蛋白能够被CT和K<,88>抗体识别。将表达的K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>蛋白纯化后免疫小鼠，再用C<,83902>大肠杆菌强毒菌株攻毒，K<,88>ac-LT<,B>蛋白具有更好的保护性。使用限制性内切酶将K<,88>ac-LT<,B>基因片段从pQE30-K<,88>ac-LT<,B>载体上切下，连接在乳酸菌表达载体(pHCElLB-pgsA)上pgsA基因的3端，构建了pHCE1LB-pgsA-K<,88>ac-LT<,B>乳酸菌表达载体。
本研究成功构建了pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88>ac-LT<,B>原核表达载体，表达出了K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合蛋白，并对表达的蛋白进行免疫应用研究；成功构建了乳酸菌表载体pHCElLB-pgsA-K<,88>ac-LT<,B>。为乳酸菌活载体口服基因工程疫苗的研究奠定了基础。