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背景和目的:恶性肿瘤已经成为危害人类健康的疾病,世界卫生组织报告显示全球恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈迅猛上升的趋势。在肿瘤的发生、发展的过程中,癌基因的激活或抑癌基因的失活起着十分重要的作用。近年来一个新的抑癌基因LKB1（Liver Kinase B1）在肿瘤学中的作用引起越来越多的关注。LKB1基因功能异常与全身多种肿瘤的发生密切相关,但绝大多数散发性肿瘤中,LKB1的突变是罕见的;而在NSCLC中LKB1的突变率高达30%。研究发现将LKB1转染至宫颈癌和恶性黑色素瘤等无LKB1表达的细胞系中,LKB1可以通过上调p21WAF1/CIP1的表达,将细胞周期阻滞在G1期,从而抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡。然而在LKB1突变率较高的NSCLC细胞中LKB1对p21WAF1/CIP1的调节作用尚不明确。此外,研究发现当细胞处于饥饿和体外分离的状态下,作为LKB1的下游激酶AMPK可以直接磷酸化p53 Ser15,增强p21WAF1/CIP1的表达,从而阻滞细胞周期的顺利进行。因此,LKB1是否通过其下游激酶AMPK磷酸化激活p53,从而增强p21WAF1/CIP1的表达尚不十分清楚。本研究首先在LKB1突变率较高的NSCLC细胞系中探讨LKB1对调节p21WAF1/CIP1的调节作用;其次,构建稳定表达LKB1sh RNA的同源细胞系;最后进一步探讨LKB1是否通过其下游激酶AMPK磷酸化激活p53,上调p21WAF1/CIP1的表达,阻滞细胞周期的顺利进行,为揭示肿瘤的发生发展提供理论基础。方法:（1）首先在NSCLC细胞系中选用LKB1突变型、p53野生型细胞（A549）转染LKB1质粒和LKB1-K78M激酶突变质粒,应用克隆形成实验检测LKB1对细胞生长的作用。其次选用LKB1突变型、p53野生型NSCLC细胞系（A549和H460）分别转染转染LKB1质粒、LKB1-K78M质粒和C2空白对照质粒,24小时后Western Blot检测p21WAF1/CIP1的表达变化;并应用流氏细胞仪检测细胞周期的变化水平;再次选用LKB1野生型、p53突变型NSCLC细胞系（H1299和Calu-1）,分别转染LKB1质粒和C2空白对照质粒,24小时后应用荧光定量PCR和Western Blot检测p21WAF1/CIP1的变化水平;最后应用同源细胞系H1299-411（LKB1 sh RNA）和H1299-PLKO.1,收集细胞沉淀,检测p21WAF1/CIP1的表达变化。（2）采用慢病毒载体系统将靶基因LKB1sh RNA转入HCT116细胞中,构建LKB1稳定抑制的同源细胞系HCT 116-LKB1sh RNA（HCT116 408）/HCT116-PLKO.1（HCT116 407）,并通过荧光定量PCR、Western Blot在m RNA和蛋白水平检测构建细胞系中LKB1的表达情况。（3）首先选用HCT 116 408（LKB1 knock down）/HCT 116 407（对照）这对同源细胞系,收集细胞沉淀,检测p21WAF1/CIP1的表达变化;应用HCT 116p53-/-/HCT116同源细胞系通过转染LKB1si RNA,24小时后Western Blot检测p21WAF1/CIP1的表达变化;其次选用HCT 116细胞系转染LKB1质粒、LKB1-K78M质粒和C2空白对照质粒,24小时后Western Blot检测p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达变化;再次用25Mm 2-DG处理HCT116细胞,24h后Western Blot检测p21WAF1/CIP1的变化水平;最后通过对HCT 116 408（LKB1 knock down）/HCT 116 407（对照）和HCT 116p53-/-/HCT 116两对同源细胞系分别给予2-DG25Mm 24h处理后,Western Blot检测p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的变化水平。结果:（1）通过克隆形成实验发现,与转入LKB1 K78M无激酶活性质粒相比,转入LKB1质粒的细胞克隆数明显减少,说明LKB1具有抑制细胞生长的作用。在LKB1突变型、p53野生型NSCLC细胞系中,转染LKB1的质粒上调p21WAF1/CIP1的表达,而空载体C2和无激酶活性的载体LKB1 K78M无此作用。同时,流式细胞结果显示与转染LKB1 K78M质粒和空白对照质粒相比,转染LKB1质粒的A549细胞G1期比例明显增加。在LKB1野生型、p53突变型NSCLC细胞系中,与空载体和无激酶活性的LKB1 K78M相比,转染LKB1质粒后在m RNA水平和蛋白水平均未见p21WAF1/CIP1的表达上调,并且流式细胞周期未见G1期比例增加。最后在p53缺失的NSCLC同源细胞系H1299-411和H1299-PLKO.1中的p21WAF1/CIP1表达也没有明显差异。（2）荧光定量PCR及Western Blot结果显示与对照细胞株HCT 116 407相比HCT116 408（LKB1sh RNA）中LKB1在m RNA水平和蛋白水平的表达水平明显降低,说明构建HCT116 408/HCT116 407同源细胞系成功。（3）HCT116 408（LKB1 sh RNA）和HCT116 407（对照）这对同源细胞系Western Blot结果显示LKB1表达下降后p21WAF1/CIP1的表达也下降。HCT116 p53-/-和HCT116这对同源细胞转染LKB1 Si RNA 48h后,Western Blot结果显示HCT116 p53-/-转染后p21WAF1/CIP1的表达没有明显变化,而HCT116转染LKB1 Si RNA后p21的表达明显下降。HCT116细胞外源性转入转染LKB1质粒、LKB1 K78M质粒和C2对照质粒,转染LKB1质粒的细胞与对照组相比,p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达均上调;2-DG处理后的HCT116与对照组比较,p21WAF1/CIP1的表达明显上调;HCT116 408和HCT116 407同源细胞系,2-DG 25Mmol处理24h后,与未加药组相比HCT116 407细胞p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达均上调,而HCT 116 408细胞p-AMPK、p-p53-Ser 15和p21WAF1/CIP1的表达未见明显变化。HCT116 p53-/-加入2-DG后与对照组HCT116相比,p21WAF1/CIP1的表达未见明显变化。结论:（1）在NSCLC细胞系中LKB1具有抑制细胞生长的作用;LKB1可以上调p21WAF1/CIP1的表达,将细胞周期阻滞在G1期,且此过程依赖激酶活性。（2）LKB1依赖p53上调p21WAF1/CIP1的表达。（3）LKB1调节p21WAF1/CIP1的机制是:LKB1通过其下游激酶AMPK磷酸化p53-Ser15,上调p21WAF1/CIP1的表达。