背景慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是一种复杂的临床疾病,发病率高,有临床症状患者的5年存活率与恶性肿瘤相仿,这类患者中约一半因恶性室性心律失常的发生而猝死。虽然心律失常是发生心脏性猝死(SCD)的重要原因,与多种离子通道有关,但是其中的潜在的电生理机制仍旧不清楚。3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)是蛋白激酶家族AGC中的一员,它位于该信号通路的上游,参与调控AGC家族下的多种调节因子,其中包括蛋白激酶B(PKB/Akt),磷酸化核糖体S6蛋白激酶(P70S6K),血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(SGK)以及叉头框蛋白O(FoxO)等。PDK1参与多种细胞生理的调控,诸如代谢、生长及生存等。此外,目前多个研究发现,该信号通路的多种上游及下游因子参与心脏心力衰竭和病理性重构的发生与发展。例如在小鼠上,当心脏特异性敲除PDK1后,可以发现心肌细胞体积缩小,心脏结构改变以及严重的心力衰竭,且于出生后的11周左右突然死亡。其中是否有心律失常的参与还不清楚。AGC家族蛋白激酶的上游因子磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的特异性阻断剂在临床上常常用于抗肿瘤的治疗,但是心律失常是其中的副作用之一。最近的研究就发现PI3K特异性阻断剂可以影响多种离子通道,延长动作电位时程(APD)。Fox O1是AGC家族蛋白激酶的主要下游调控因子之一,最近的研究发现它可能是钠通道负向调控因子。而且,钠通道功能的下降与临床上传导阻滞(AVB),3型长QT间期综合征(LQT3)和Brugada综合征(Brs)有关,这类患者的主要死亡原因之一就是心律失常。因此,PDK1作为该信号通路的主要上游因子,是否参与心脏钠通道以及其他离子通道的调控,乃至多种病理情况下心律失常的发生,值得进一步的研究。因此,本研究构建心脏特异性敲除pdk1的小鼠模型,运用全细胞膜片钳和westernblot技术,研究心脏动作电位,多种离子通道之间变化及可能原因,探讨pdk1参与心律失常发生的潜在机制。实验内容1.心脏特异性敲除pdk1小鼠的鉴定与电生理改变的初步探索目的:心脏特异性敲除pdk1小鼠模型的鉴定。方法:采用westernblot方法,检测小鼠心室肌细胞pdk1的表达情况;运用体表心电图检测基因敲除后小鼠心率、qrs、qtc的变化。结果:基因敲除后的8周,心室肌pdk1的表达显著下降。且心电图表现为心率下降(362.22±12.69vs.422.31±20.10,p<0.05),qrs(12.81±0.30msvs.18.93±1.17ms)、qtc(82.69±4.08msvs.113.91±8.20ms)时程的延长,11周即出现了一定程度的心脏传导异常。结论:心脏特异性敲除pdk1小鼠模型构建是有效的,且出现了初步的电生理异常。2.小鼠心肌细胞的分离目的:建立稳定的急性分离小鼠心室肌细胞的方法。方法:采用酶解法分离小鼠心室肌细胞,使用改良langendorff装置和灌流液,经主动脉逆行性灌流ii型胶原酶消化心肌,得到单个心室肌细胞。结果:经过ii型胶原酶的消化,在pdk1基因敲除以及正常小鼠上均可获得长杆状,边缘及横纹清晰的存活心室肌细胞。结论:稳定的急性分离小鼠心室肌细胞的方法已构建成功。3.pdk1对小鼠心脏钠通道的调控目的:探索心脏pdk1敲除后对于心室肌细胞钠通道的影响以及可能的机制方法:运用全细胞膜片钳方法,比较pdk1基因敲除后心室肌钠通道电流以及相关动力学的变化。运用westernblot技术,检查pdk1下游信号通路的改变。结果:心脏特异性敲除pdk1后,小鼠心室肌细胞钠电流密度下降(-23.86±1.10pa/pfvs.-36.34±1.45pa/pf,p<0.05),且11周大小鼠有着类似的改变(-24.11±1.23pa/pfvs.-36.76±2.07pa/pf,p<0.05),但是钠通道动力学仅有轻度变化。westernblot检测发现小鼠pdk1信号通路下游308位点akt磷酸化下降,24位点foxo1磷酸化下降,且细胞核中foxo1表达上升,钠通道蛋白表达下降。结论:pdk1敲除可以通过抑制钠通道蛋白的表达来抑制心室肌细胞钠通道电流的密度,潜在的机制可能是通过调控下游信号通路的磷酸化,通过提高钠通道负向调控因子foxo1在细胞核的表达来调控的。4.pdk1对乳大鼠心室肌钠通道的调控目的:排除pdk1敲除对心功能的影响因素,进一步证实pdk1敲除导致钠电流下调的机制。方法:在培养的乳大鼠心室肌细胞上,运用pdk1特异性阻断剂gsk2334470,akt特异性阻断剂mk2206,foxo1特异性阻断剂as1842856或联合使用,分别运用全细胞膜片钳技术和westernblot技术,观察钠通道电流的变化以及相关信号通路的变化。结果:运用pdk1特异性阻断剂gsk2334470和akt特异性阻断剂mk2206后,乳大鼠心室肌细胞的钠电流密度下降从-36.23±1.25pa/pf分别下降至-27.52±1.49pa/pf和25.48±2.06pa/pf。相反,这种抑制效应可以被foxo1特异性阻断剂所抵消。westernblot实验中运用了pdk1特异性阻断剂和foxo1特异性阻断剂探索了钠通道的表达变化,此外细胞核中foxo1的变化与pdk1敲除的小鼠类似。结论:实验结果进一步说明PDK1可以通过对于下游调控因子的FoxO1的调控来调节心室肌细胞钠通道功能。5.PDK1对小鼠心室肌细胞电生理的影响目的:进一步探索PDK1在心律失常的发生中发挥的作用。方法:运用全细胞膜片钳技术,检测小鼠心室肌细胞动作电位时程的变化,EAD的诱发,以及复极相关主要离子通道的功能变化。结果:心脏特异性敲除PDK1后,小鼠心室肌细胞APD显著延长,L型钙电流(49%)以及Ito电流都显著抑制(89%),但EAD诱发几率和正常小鼠相比无显著差异。结论:PDK1敲除延长动作电位时程主要是通过抑制瞬时外向钾电流来完成的,它可能在心脏心律失常发生发展中发挥了重要作用。