研究背景：国际癌症研究机构的最新资料表明,肝癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一,2008年全球肝癌患者74.9万,死于肝癌的患者69.4万,其中中国肝癌患者40.1万,死于肝癌的患者37.1万。据中国卫生部《2010中国卫生统计年鉴》显示,2009年恶性肿瘤已跃居我国主要疾病死亡率的首位,而其中肝癌位居恶性肿瘤死亡率的第二位。肝癌死亡率高的原因之一是当前肝癌的确诊通常是在晚期,因而错过了最佳的治疗时期。人体中有一半以上的蛋白质发生了糖基化修饰,蛋白质糖基化不仅影响蛋白空间结构、生物分布、生物功能,而且还在细胞之间信号传导和识别、细胞分化等过程中扮演重要角色。研究发现,蛋白质糖基化的异常表达与肿瘤等多种疾病相关。目前,经FDA认证的19种疾病的生物标志物均为糖蛋白。作为一种可以特异性识别糖蛋白糖链的蛋白类物质,凝集素可以被用于从血清中分离纯化目的糖蛋白,并能减少高丰度蛋白对糖蛋白质分析鉴定的影响。双向电泳和质谱技术被广泛应用于糖蛋白质组学的研究,所以利用凝集素分离纯化肝癌血清中的糖蛋白并进行双向电泳和质谱分析鉴定,可以找出潜在的肝癌标志物,为肝癌的诊断提供帮助。方法：利用本实验室已经建立的凝集素磁性微粒复合物分离糖蛋白的技术平台,应用小扁豆凝集素磁性微粒复合物从40份混合肝癌患者血清和40份混合健康志愿者血清中分离纯化糖蛋白。通过对分离纯化的糖蛋白进行双向电泳分析,找出肝癌患者与健康志愿者血清中LCA识别糖蛋白的差异。并应用LC-MS/MS定量分析肝癌患者和健康志愿者LCA凝集素提取的糖蛋白,寻找潜在肝癌标志物。结果：1.通过对LCA磁性微粒复合物分离纯化的糖蛋白双向电泳分析,ImageMaster 7.0在肝癌患者血清LCA结合糖蛋白图谱中找到了322±6个点,在健康志愿者血清LCA结合糖蛋白图谱中找到245±8个点,分析肝癌患者血清LCA结合糖蛋白图谱和健康志愿者血清LCA结合糖蛋白图谱,找到匹配蛋白有152±5个,找到有显著差异的蛋白点22个。2.用Trypsin和PNGase F对LCA磁性微粒复合物分离纯化的糖蛋白进行溶液内酶解,用LC-MS/MS进行鉴定,结果如下：(1)肝癌患者血清中鉴定的LCA结合的糖蛋白有35个,其中已经在Swiss-Prot公布为糖基化蛋白有25个；通过糖蛋白糖基化预测软件NetNGlyc预测含有N-糖基化位点的蛋白有5个,其中3个在质谱结果中鉴定为糖基化蛋白；预测软件NetOGlyc预测含有O-糖基化位点的蛋白有2个；另外,非经典N-X-S/T糖基化特征序列蛋白2个；LC-MS/MS鉴定有糖基化位点的蛋白有1个。(2)健康志愿者血清中鉴定的LCA结合的糖蛋白有36个,其中已经在Swiss-Prot公布为糖基化蛋白有26个；通过糖蛋白糖基化预测软件NetNGlyc预测含有N-糖基化位点的蛋白有5个,其中3个在质谱结果中鉴定为糖基化蛋白；预测软件NetOGlyc预测含有O-糖基化位点的蛋白有2个；另外,非经典N-X-S/T糖基化特征序列蛋白2个；LC-MS/MS鉴定有糖基化位点的蛋白有1个。(3)在肝癌患者和健康志愿者血清中共同存在的LCA结合的糖蛋白有26个,仅在肝癌患者血清中存在的有9个,仅在健康志愿者血清中存在的有10个。(4)运用emPAI指数分析方法对鉴定的糖蛋白进行定量分析,在肝癌患者和健康志愿者血清中共同存在的26个LCA结合糖蛋白,其中C4b-binding protein alpha chain、Protein AMBP、Alpha-1-antitrypsin 3个蛋白在肝癌患者血清中含量与健康志愿者中血清含量的比值在1.5倍以上,为高表达的糖蛋白；Apolipoprotein A-Ⅰ、Apolipoprotein A-Ⅱ、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Beta-2-glycoprotein 1、IGL@ protein6个蛋白在肝癌患者血清中含量与健康志愿者中血清含量的比值在0.6倍以下,为低表达的糖蛋白。结论：LCA磁性微粒复合物可以被应用于从血清样本中分离纯化LCA识别的糖蛋白；通过对鉴定到的可作为肝癌潜在标志物的12个糖蛋白文献检索后发现其中的4个糖蛋白已经报道可作为肝癌患者血清中的生物标志物,发现了8个肝癌患者血清中高表达的糖蛋白。