研究背景和目的：白血病是严重危害人类健康的疾病，且由于环境等恶化，白血病的发病呈上升趋势。越来越多的研究者都开始关注白血病的发生机制，试图通过探索白血病的发病机制找到白血病治疗的有效途径。最新的有关白血病的研究表明：γ分泌酶抑制剂可以通过调节Notch1信号通路抑制白血病细胞的增殖，有望成为白血病治疗的新途径。γ分泌酶是膜内切割蛋白酶家族(intramembrane-cleaving-proteases, I-Clips)的成员，该家族的酶都可以在脂质双分子层内部催化肽键水解。Γ分泌酶广泛存在于体内的组织细胞中，可以切割多种I 型跨膜蛋白，如β-淀粉样多肽的前体蛋白（APP）, Notch受体, CD44, E-钙黏蛋白等。生物化学及基因方面的证据表明：γ分泌酶由4个亚基组成，它们分别为PS1(presenilin), NCT(nicastrin), APH1(anterior-pharynx-defective-1),PEN2(presenilin enhancer-2,4个亚基按照1:1:1:1的比例组合，空间排列紧密有序。γ分泌酶四个亚基功能各异，PS1是催化亚基，有切割底物的功能，在生物体中，PS1首先以无活性的全蛋白形式分泌，再经生理性分子内部水解，裂解为由～20Kda的PS1-C 端（PS1-CTF）和～30Kda的PS1-N 端（PS1-NTF）构成的异源二聚体，有催化活性的PS1都是以异源二聚体的形式存在的，PS1发生突变是阿尔茨海默病(AD)发病的重要原因；APH1和PEN2是2个较小的亚基，APH1是γ分泌酶复合体组装过程中的“支架”，能够稳定有活性的PS1；NCT是γ分泌酶的重要亚基，发挥着“底物受体”的作用，即γ分泌酶的底物被PS 切割之前，要先被NCT 特异识别并结合，NCT 广泛存在于人体和大鼠的所有细胞系，与γ分泌酶的组装和成熟密切相关，研究者证明：NCT的高表达可以通过提高γ分泌酶的活性进而促进对其底物A β的切割，因此是阿尔茨海默病治疗的潜在靶点。Notch基因广泛存在于多种物种中，其家族成员在进化上高度保守，介导的信号通路更是参与了胚胎发育、血细胞发育和肿瘤形成等多个病理生理过程。在白血病细胞的增殖分化决定中，Notch 发挥着重要的作用。Notch是γ分泌酶的底物，迄今为止，在哺乳动物体内发现了4种基因，他们编码4种跨膜受体蛋白，分别为Notch1-4。目前对Notch1的了解较为深入，Notch1在体内依次经过ADAM 金属蛋白酶、γ分泌酶切割后在细胞膜上释放活性胞内片段ICN1(Intracellular domain Notch1)入核，在核内，ICN1通与转录调节因子CSL 结合，同时招募MAML，形成 CSL-ICN1-MAML三元复合物，该复合物可作为转录活化因子，激活 HES(hairy enhancer of split)、HRP(HES —related repressor protein)等Notchl靶基因的转录，进而对细胞增殖和分化起始的过程进行精确调控。NCT在此生理过程中发挥重要的作用，NCT 突变可以导致在生长发育各个阶段的细胞命运决定缺陷。因此本实验最初旨在通过高表达NCT提高γ分泌酶对Notch1的切割，进而观察对白血病细胞增殖和分化的影响。因此在第一部分实验中，我们构建了pcDNA3.0-NCT 重组质粒，在HL-60细胞中表达并且获得稳定高表达NCT的细胞株，通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测细胞的生长和分化情况，检测结果与预期相反：NCT 高表达抑制白血病细胞的增值，促进白血病细胞的分化。因此我们假设，γ分泌酶可以通过影响其他信号通路调节白血病细胞的生长和分化。LIF，白血病抑制因子，是一种多效性细胞因子，可作用于多种组织细胞发挥不同的生物学作用，比如刺激血小板生成，造血细胞增殖；促进神经原形成，肌肉卫星细胞的增殖，参与神经肌肉修复。这些生物学效应的发生依赖于LIF和细胞膜上LIF受体（LIFR）结合启动下游信号通路，靶细胞膜上的LIFR β亚基（gp190），可与LIFR β亚基（gp130）形成异源性二聚体，进而激活下游信号转导通路。人们已证明，生理状态下存在可溶性和完整性gp190两种形式。可溶性LIFR 游离于胞外，无跨膜区和细胞内区，可以拮抗LIF 发挥的正常生理效应。Gp190是LIF的特异性受体，完整性gp190包括胞外区、跨膜区和胞内区，其胞内区含有三个功能域，由近膜端至远膜端依次为BOX1、BOX2和BOX3，以往的研究工作表明，在无LIF 诱导的情况下，高表达LIFR α亚基gp190也可以激活白血病细胞下游的信号转导通路。设计包含BOX3的小分子-190CT3，并在白血病细胞中高表达，通过检测JAK/STAT3 以及P44/P42MAPK信号转导通路下游信号分子以及磷酸化水平，发现其确实具有LIF 受体的信号启动效应从而抑制白血病细胞的生长。Gp190是I 型跨膜蛋白，γ分泌酶能够切割I 型跨膜蛋白进而影响下游信号通路，因此我们大胆提出γ分泌酶能够切割gp190产生gp190-CTF的假设，本实验第二部分别通过抑制和提高γ分泌酶的活性来探索γ分泌酶和gp190的关系，我们首先通过γ分泌酶抑制剂干扰实现酶活性的下降，再通过NCT的过表达实现γ分泌酶对底物切割作用的提高，从正反两个方面验证我们的假设。目前对于NCT的研究重点主要集中在NCT与阿尔茨海默病的关系上，更多的研究者企图通过γ分泌酶抑制剂的应用来抑制γ分泌酶的活性，进而阻止A β的产生，起到对阿尔茨海默病的治疗作用，关于γ分泌酶和其他I 型跨膜蛋白的关系则研究很少。本实验分两个部分创新的探讨了高表达NCT对白血病细胞增殖和分化的影响，对进一步研究γ分泌酶在造血系统中的作用奠定了基础，为白血病的治疗提供了新的可能性。　　 第一部分、Nicastrin 重组质粒的构建以及其在HL-60细胞中的表达及鉴定方法：　　 (1)重组质粒pcDNA3.0-NCT的获得及鉴定：设计引物5-CGGGGTACCAGAGGCAAGATGGCTACGGCAG-3，5-TTTGCGGCCGCCCCAGGGAGGTTCCAGTGACAA-3，以MSCcDNA为模板，PCR 获得包含NCT蛋白编码区的目的片段，共2.174kb。PCT 产物经KpnI、NoTi酶切、T4 连接酶连接、转化、挑选克隆后成功构建载体pcDNA3.0-NCT，且测序正确。（2）重组质粒pcDNA3.0-NCT转染HL-60，同时设置pcDNA3.0空质粒转染组、野生组HL-60作对照组。G418 筛选转染pcDNA3.0-NCT及pcDNA3.0组HL-60细胞15d，挑选生长旺盛的克隆扩增，离心收集细胞，通过RT-PCR和蛋白印迹(Western blot)进行蛋白半定量检测，获得稳定高表达NCT的HL-60细胞株，保存以备后面实验使用。　　 结果：（1）PCR 产物电泳后与紫外灯下观察可见大小相符合的片段，约2.2kb；重组质粒依次经KpnI、NoTi酶切后、电泳紫外灯下观察可见大小约5.2kb和2.2kb 左右的片段，质粒测序结果与Genbank 核酸序列数据库中NCT 序列比对，匹配率100％，成功获得重组pcDNA3.0-NCT的真核表达质粒。（2）G418 筛选后获得稳定转染pcDNA3.0-NCT的HL-60细胞株,RT-PCR、Westernblot 半定量检测NCT mRNA及蛋白表达，结果显示：和对照组细胞NCT表达水平相比，pcDNA3.0-NCT 转染组NCT的表达量明显升高，我们获得稳定高表达NCT的细胞株，保存以备下一步实验。（3）绘制生长曲线，与对照组细胞相比，pcDNA3.0-NCT 转染组细胞生长受到抑制。流式细胞仪显示pcDNA3.0-NCT 转染组细胞表面CD15/CD11b表达最高。　　 结论：（1）KpnI、NoTi双酶切鉴定、测序均证明我们成功构建了重组质粒pcDNA3.0-NCT；（2）G418 筛选生长旺盛的阳性克隆，经半定量RT-PCR 检测、Westernblot 检测获得稳定高表达NCT的HL-60细胞株；（3）相比pcDNA3.0转染组以及野生组细胞，转染NCT的HL-60细胞增殖受到明显抑制，CD15及CD11b的表达量增高，细胞向成熟方向分化。　　 第二部分、LIF 受体α亚基gp190以及与γ-secretase 关系的研究方法：　　 （1）γ分泌酶抑制实验：将NCT 高表达组、空质粒转染组、野生组细胞培养在12孔板中，每组细胞4孔，每孔细胞生长至1×107，加入γ分泌酶抑制剂，抑制剂浓度分别为：0nM （DMSO），25 nM，50nM，和100nM，抑制时间均为8小时，抑制剂浓度和时间通过预实验确定，8小时后，裂解细胞，western blot 检测gp190全长(gp190-FL)及gp190-CTF，PS1-NTF、PS1全长(PS1-FL)、NCT的表达情况；（2）pcDNA3.0,wild type，pcDNA3.0-NCT 转染组细胞生长至1×107 离心收集细胞，westernblot 检测gp190-FL,gp190-CTF,NCT的表达水平。（3）LIF 刺激试验：pcDNA3.0-NCT组、pcDNA3.0组、野生组细胞生长至1×107后加，入浓度为60ng/ml的LIF，LIF 刺激时间分别为12h、24h、48h 之后，分别离心收集三组细胞，western blot 检测gp190-FL,gp190-CTF,PS1-FL,PS1-NTF的表达；LIF 刺激浓度通过预实验确定。（4）检测pcDNA3.0-NCT、pcDNA3.0、野生组HL-60细胞下游信号分子STAT3 磷酸化水平，细胞生长至1×107，离心收集细胞，western blot 检测三组细胞STAT3的磷酸化水平。（5）免疫共沉淀检测gp190和NCT的相互作用情况，LIFR抗体做沉淀，NCT抗体做western blot。　　 结果:（1）γ分泌酶抑制剂干扰实验结果示：加入γ分泌酶抑制剂后，随着抑制剂浓度的逐渐增加，PS1-NTF表达逐渐减弱，PS1-FL蛋白的表达增高，这标注着γ分泌酶活性逐渐下降;gp190-CTF的表达逐渐减弱，NCT和gp190-FL的表达未见明显变化；（2）和pcDNA3.0转染组以及野生型HL-60相比，pcDNA3.0-NCT 转染组细胞，PS1-NTF表达逐渐增加，PS1-FL蛋白表达减少，这标志着γ-secretase分泌酶活性升高;gp190-CTF表达逐渐增加，gp190-FL表达各组细胞间未见明显区别。　　 结论：（1）γ分泌酶抑制实验，酶活性受到抑制后，gp190-CTF表达减弱，且gp190-CTF的表达量和γ分泌酶抑制剂浓度呈反比，随着γ分泌酶抑制剂浓度的逐渐增加，gp190-CTF表达逐渐减弱；（2）NCT 高表达组HL-60细胞，westernblot 检测可见更多的gp190-CTF表达；（3）对每组细胞而言，随着LIF 刺激时间的增加，gp190-CTF的表达逐渐增加。（4）STAT3 磷酸化表达水平的检测示：STAT3的磷酸化水平为pcDNA3.0-NCT 〉pcDNA3.0〉野生组HL-60。（5）加入gp190抗体免疫共沉淀检测可以检测到NCT的表达。综上所述，第二部分实验表明，γ-secretase 可能有切割gp190，产生游离C 末端的作用,且通过影响下游信号分子STAT3 磷酸化水平-调节HL-60细胞的增殖和分化。　　 小结：本实验的两个部分围绕γ分泌酶和gp190相互关系以及对白血病细胞生长和分化的研究展开。通过构建及转染pcDNA3.0-NCT 获得稳定高表达NCT的HL-60细胞，并观察到NCT 高表达可以抑制白血病细胞的增殖、促进白血病细胞的分化。研究γ分泌酶和gp190关系的实验表明：随着γ分泌酶抑制剂浓度的增加，gp190-CTF表达逐渐减弱;NCT 高表达导致gp190-CTF表达明显升高。pcDNA3.0,pcDNA3.0-NCT,野生组细胞均随着LIF 刺激时间增长，gp190-CTF的表达逐渐增加，且NCT 高表达可以促进细胞内信号分子STAT3的磷酸化水平；免疫共沉淀的结果揭示了gp190和NCT的相互作用。　　 实验总结：生理状态下，γ-secretase 可能切割gp190产生细胞内的游离功能域，参与信号传递过程，进而抑制白血病细胞的增值、促进白血病细胞分化。本实验创新的研究了γ分泌酶与LIFR α亚基gp190的关系，为研究γ分泌酶在造血系统的关系奠定了基础，为白血病治疗寻找新的靶点提供了可能性。