论文部分内容阅读
目的随着细胞生物技术的发展,越来越多的研究发掘出干细胞重要功能与潜力后,使用干细胞移植来修复受损组织的方法被寄予了极大的期望。作为先进的无创检测手段以及细胞治疗的基础，SPIO标记示踪技术也在发展中逐渐成熟完善起来。使用SPIO对移植干细胞动态监测和示踪目前已经成为现实。此外，由于SPIO超顺磁性的氧化铁核心颗粒具有极其敏感的磁性，外加磁场可以使内部的SPIO颗粒顺磁性的方向进行排列运动，但SPIO的磁性发挥有明显的时效性，磁场一旦撤除，其磁性立即消失。利用这个特性，标记后的间充质干细胞可以在磁场的作用下向脑缺血部位定向移动,提高由尾静脉注射干细胞到达大鼠脑缺血部位从而达到靶向治疗的目的。但由于SPIO的铁对干细胞的毒副作用，如果过量聚积时，就会有引起中毒问题以及细胞变性坏死，特别是细胞周围的铁浓度快速升高时可以明显抑制标记细胞的增殖能力，造成细胞分化缓慢、功能障碍，有的甚至发生凋亡。本研究的目标在于（1）通过体外试验对SPIO标记后骨髓间充质干细胞增殖能力及细胞活力进行检测从而评估SPIO使用的安全性。（2）在大鼠脑外缺血局部增加磁场，使SPIO标记的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向迁移至病灶部位，通过对试验组与对照组动物大鼠模型的神经损害严重程度评分、组织学检查、脑组织铁含量、脑缺血面积测量等方面的分析来了解外加磁场对被标记细胞迁移的影响以及BMSCs对改善脑缺血症状的疗效，为临床使用提供依据。方法本研究使用清洁级SD大鼠30只。体外培养常规培养BMSCs，通过随机对照试验将试验组BMSCs用SPIO标记培养，用普鲁士蓝染色测定标记率；台盼蓝染色测定细胞存活率；CCK法检测磁场对标记干细胞的增殖活力；进一步引入外加磁场的影响，设置对照组为未标记的BMSCs，标记组为标记细胞未加磁场，磁铁组为标记细胞同时外加磁铁，并且在培养皿底部距磁铁边缘0mm、3mm、6mm、9mm、12mm、15mm、18mm处做标记，培养24h后观察其磁体区细胞聚集情况以及测算细胞计数。体内试验部分使用Longa的方法，各组动物规范化制备MCAo模型，并将大鼠随机分为IO组、ICS组和ICSM组，用尾静脉注射移植细胞；对移植后大鼠进行神经学评估；普鲁士蓝染色观察脑组织内标记细胞；TTC染色观察脑缺血面积；分光光度计检测脑组织铁含量，从而外加磁场对被标记细胞迁移的影响以及BMSCs对改善脑缺血症状的疗效。结果1、体外试验部分：细胞标记率接近100%，台盼蓝染色检测对照组、SPIO组和磁场组BMSCs的活力以及CCK检测在磁场的影响下BMSCs的增值能力，三组两个时间点生存率均无明显差异（P>0.05）。在磁铁迁移BMSCs试验中，在距磁铁边缘0mm到12mm内普鲁士蓝染色观察磁性标记BMSCs静脉移植并加外加磁场组（ICSM组），BMSCs明显多于未磁性标记BMSCs静脉移植组（ICS组）（P<0.01），在12mm～18mm细胞数无明显差异(P>0.05)。2、体内试验部分：移植后7dICSM组动物神经系统行为学评分明显改善(P<0.05)，ICSM组脑组织内铁含量明显多于ICS组（P<0.05）。结论SPIO的安全窗好，其剂量远小于毒性阈值，一般不会造成铁的过度积聚。标记后对细胞的成活力以及增殖能力均无明显影响，而且通过检测可以发现BMSCs被SPIO铁颗粒标记后，其本身的更新分化能力无任何变化。在体内和体外使用外加磁铁均可以定向迁移标记的BMSCs，明显的提高经尾静脉移植标记SPIO的BMSCs到达脑缺血部位的成功率。