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研究目的随着城市化进程加快,酒精滥用问题日益严重,长期饮酒将增加酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM)的发生风险。ACM主要表现为左心室扩张、心脏功能异常,并可能伴随包括心肌胰岛素抵抗在内的多种病理变化,而心肌胰岛素抵抗被认为是导致心力衰竭的原因之一,与左心室功能不全密切相关。研究表明miR-155在胰岛素信号传导中起着重要作用。此外,mTOR信号通路具有多种心血管活性,且mTOR信号通路成员Rheb(ras homolog enriched in brain)、Rictor(rapamycin insensitive companion of mTOR)和 S6K2(ribosomal protein S6 kinase 2)已被证实为miR-155的靶基因,但miR-155对mTOR信号通路的调控是否参与了乙醇诱导的心肌胰岛素抵抗尚不清楚。本研究分别在乙醇刺激的H9C2心肌细胞以及长期酒精喂养的Wistar大鼠中进行探索和验证,旨在确定miR-155失调对乙醇暴露后心肌葡萄糖摄取和胰岛素抵抗的影响机制,以进一步寻找ACM的潜在治疗靶点。研究方法1.细胞培养:H9C2大鼠心肌细胞系于含有1%青霉素-链霉素,10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃贴壁培养。2.2-NBDG摄取实验:H9C2细胞转染siRNA沉默或过表达miR-155后,采用2-NBDG摄取实验反映乙醇刺激下H9C2细胞的葡萄糖摄取能力,同时采用荧光显微镜观察荧光强弱。3.动物模型建立:采用自由饮酒方式建立长期饮酒大鼠模型,选取体重160-200g的Wistar雄性大鼠50只,随机分为模型组和对照组,一周适应性喂养后根据每组大鼠的平均体重计算酒精稀释比,给予大鼠3%乙醇溶液代替水3天,6%代替水4天,最后以10%乙醇溶液作为唯一的液体来源,持续酒精喂养5个月。控制模型组大鼠每日饮酒量为6.5-8.0g/kg体重。4.超声心动图检测:评价长期饮酒大鼠心脏形态、功能及过表达miR-155后大鼠心脏形态、功能改变。检查指标包括:左室舒张末期内径、左室收缩末内径、左室射血分数、舒张末期容积、每搏输出量、短轴缩短率、左心室厚度等。5.心脏腺相关病毒注射:采用原位注射法分别向长期饮酒大鼠心肌注射含有miR-155前体或空白质粒的腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)。注射病毒颗粒总数为5x1011个。6.蛋白免疫印迹实验:检测沉默或过表达miR-155后乙醇刺激下H9C2心肌细胞mTOR信号通路上下游分子Rictor、Rheb和S6K2的表达水平以及胰岛素受体底物 1 的磷酸化水平(phosphorylated insulin receptor substrate-1,p-IRS1);检测对照组及模型组大鼠心肌p-IRS1(Ser)蛋白表达量;检测模型组、病毒转染组及转染对照组大鼠心肌胰岛素敏感性相关分子表达水平;检测对照组、模型组、病毒转染组及转染对照组大鼠心肌组织mTOR信号通路上下游分子Rictor、Rheb和S6K2的表达水平。7.实时荧光定量PCR:检测乙醇刺激前后H9C2细胞中miR-155表达量;检测大饮酒前后大鼠心肌miR-155表达;检测转染腺相关病毒后miR-155的表达量以及过表达miR-155前后大鼠心肌组织mTOR信号通路上下游分子Rictor、Rheb和S6K2的mRNA表达水平。研究结果1.乙醇刺激对H9C2心肌细胞miR-155的影响100mM的乙醇刺激24h后,H9C2细胞中miR-155表达上调2.5倍(P<0.01)。2.miR-155失调对H9C2细胞葡萄糖摄取的影响首先,我们验证了 miR-155抑制剂(inhibitor)和模拟物(mimics)的有效性,选择300pmol剂量用于后续转染。流式细胞术分析显示,乙醇刺激下,抑制miR-155表达,H9C2细胞2-NBDG摄取能力减弱,相对荧光强度减弱21.1%(P<0.01),而过表达miR-155后相对荧光强度增加了 37.9%(P<0.01)。3.miR-155失调对H9C2细胞胰岛素敏感性的影响Western blot检测结果显示,乙醇刺激下转染miR-155-5p抑制剂后,p-IRS1(Ser)的相对表达增加了 19.1%(P<0.05),而miR-155过表达则导致p-IRS1(Ser)表达下降,下降幅度为12.7%(P<0.05)。4.miR-155调控mTOR信号通路体外转染miR-155-5p inhibitor和mimics后,western blot检测乙醇刺激下H9C2细胞mTOR信号通路上下游的分子表达。结果表明,抑制miR-155表达后Rictor、Rheb、S6K2 蛋白水平分别上调 29.1%(P<0.05)、16.0%(P<0.01)和35.6%(P<0.05)。而过表达miR-155后上述分子表达降低,下降幅度为28.0%(P<0.01)、28.9%(P<0.01)和 27.9%(P<0.01)。5.长期饮酒对大鼠心脏形态功能及心肌胰岛素敏感性的影响自由饮酒5个月后,通过超声可见长期饮酒导致大鼠心脏形态发生改变,差异具有统计学意义,其中舒张期左室内径较对照组相比增大13.5%(P<0.05),左室舒张末容积增大45.4%(P<0.05),心输出量增多56.5%(P<0.05),舒张期左心室厚度增大19.7%(P<0.05),收缩期左心室厚度增大32.5%(P<0.05)。采用western blot检测p-IRS1(Ser)的表达水平,结果显示长期饮酒导致大鼠心肌组织 p-IRS1(Ser)表达上调 66.1%(P<0.01)。6.mTOR信号通路在乙醇诱导的心肌胰岛素抵抗中的作用PCR结果显示与正常组相比,长期饮酒导致大鼠心肌Rictor、Rheb和S6K2的 mRNA表达水平分别上调了 23.0%(P<0.01),33.3%(P<0.01)和 57.7%(P<0.01)。此外,蛋白表达也分别升高 48.5%(P<0.05)、111.1%(P<0.05)和 165.4%(P<0.05)。7.长期饮酒对大鼠心肌组织miR-155的影响q-PCR检测大鼠心肌组织miR-155的表达,发现长期饮酒导致大鼠心肌组织miR-155 的表达量升高 50.4%(P<0.01)。8.验证miR-155对mTOR信号通路的调控作用长期饮酒大鼠心肌转染miR-155-5p腺相关病毒后,miR-155表达量提高167.4%(P<0.01),与此同时大鼠心肌mTOR信号通路上下游分子Rictor、Rheb、S6k2 mRNA 水平表达分别降低 22.0%(P<0.01)、26.5%(P<0.01)和 27.3%(P<0.01);蛋白水平表达降低 51.0%(P<0.01)、46.4%(P<0.05)和 47.4%(P<0.01)。9.过表达miR-155对长期饮酒大鼠心脏形态功能及心肌胰岛素敏感性的影响超声心动图显示,过表达miR-155后,大鼠舒张期左室内径、舒张末容积、心输出量增等指标变化无统计学意义。Western blot结果显示,过表达miR-155后,大鼠心肌p-IRS1(Ser)蛋白表达量下降53.8%(P<0.01),葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4,GLUT-4)表达量提高 116.1%(P<0.01),磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)蛋白表达量提高 51.3%(P<0.01)。结论1.长期饮酒导致大鼠左心室扩张,心肌胰岛素敏感性受损。2.乙醇刺激上调心肌miR-155表达。3.过表达miR-155抑制mTOR信号通路。4.过表达miR-155改善乙醇刺激下心肌葡萄糖摄取障碍及胰岛素敏感性受损。