近几年来我国肉制品掺假现象比较严重。羊肉在肉类产业中占据很大的比重,且有非常高的消费需求。然而,不法商贩用其他肉种如鸭、鸡、和猪肉混在羊肉中,有的甚至替代羊肉。尤其是熟肉制品掺假率更高,目前,对生肉的检测技术相当成熟,由于加热引起蛋白质发生变化导致熟肉制品的鉴别过程很复杂。酶联免疫技术检测肉类的掺假最大的缺点是需要的目的蛋白在加热过程中变性,无法通过抗体检测,研究发现,动物肌肉中的肌肉蛋白质具有很好的热稳定性以及物种里有特定的热肌红蛋白等,这些发现解决了酶联免疫技术的难题。根据一些文献报道,肌肉中的肌红蛋白是一种热稳定蛋白质,以羊肌红蛋白(MMb)作为一种特异性的指标使用在酶联免疫吸附技术来检测羊肉掺假。本实验通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)软件得到羊肌红蛋白(MMb)的氨基酸序列,对MMb的氨基酸密码子进行了优化。经由重叠PCR设计并合成出了MMb的全基因。用NdeI和XhoI酶将目的基因和载体pET-28a双酶切后由T4连接酶进行连接,最终得到表达正确的重组质粒MMb-pET-28a,并将其导入到大肠杆菌Rosetta(DE3)体内并在诱导剂下得以表达,经SDS-PAGE检测后,成功表达出可溶性MMb蛋白,并由Ni-IDA亲和柱对MMb提纯,测定MMb融合蛋白的浓度为1 mg/mL。通过把MMb与其它物种的氨基酸序列对比分析之后得到特异性相对好的MMb多肽段,并把此肽段同载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联为大分子抗原并在BALB/c小鼠体内注射,取其脾细胞进行细胞融合。经亚克隆筛选得出了效价最高的2-1-8细胞株,达到3.2×10~6,通过小鼠腹腔制备出腹水并由Protein G纯化单抗得到的效价为1:64K,特异性分析良好。建立了MMb间接竞争ELISA法,其中MMb最佳包被浓度是1μg/m L,1%BSA为最适封闭液并于37 ~oC进行1 h的封闭,单克隆抗体的最适稀释条件为1:16000,酶标二抗的最适稀释条件是1:5000。拟合的线性回归方程是y=-9.5x+102.84,R~2=0.9885,5-1000 ng/mL是其最佳的检测范围,最低检出限为1 ng/mL,精密度中板内误差是6.25%,板间误差平均为8.15%。回收率在95.38%-101.78%,有良好的特异性并和鸭、鸡、猪等没有交叉反应的发生。用建立的ELISA能够准确的检测出不同比例的混合生肉中生羊肉和混合熟肉中的熟羊肉的含量,可用于生、熟羊肉或羊制品中相关羊肌红蛋白的检测。