伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhi)是引发人类急性肠道传染病伤寒的病原菌,具有强的侵袭性,产生内毒素,由粪-口途径传播。伤寒是一种以发热为主要表现的全身性疾病,曾在世界各地流行。随着生活卫生条件的改善和抗生素(特别是氯霉素)的使用,伤寒的发病率与其导致的死亡率在发达国家有大幅度的下降,而在亚非拉的一些发展中国家依旧是一个重要的公共卫生问题。伤寒的常规治疗方式是抗生素疗法,但抗生素的长期使用造成了伤寒菌多重耐药株的产生。而接种疫苗,是除了改善卫生条件之外最有效的预防和控制手段,目前在全球范围内广泛使用的是注射用Vi多糖疫苗和口服的Ty21a活疫苗。由于多糖疫苗属于非T细胞依赖性抗原,免疫后不形成免疫记忆,产生的抗体主要是亲和力较低的Ig M和Ig G2,且不能在婴幼儿体内产生有效的免疫力,而将细菌的聚糖与适当的蛋白载体结合形成糖蛋白疫苗,属于T细胞依赖性抗原,能够产生更好、更长久的免疫保护效果。细菌中存在糖基化修饰、细菌蛋白糖基化过程与脂多糖的合成的相似性以及pgl基因簇具有糖基化底物蛋白功能的发现,使得O抗原与免疫蛋白载体在细菌体内结合成为了可能。本文采用改进的λ-Red重组系统,成功构建了伤寒菌50096 waa L基因缺失株,同时利用低拷贝质粒成功构建了waa L回复株。对这野生株和新构建的缺失株、回复株进行脂多糖(LPS)银染实验,鉴定3株菌LPS表型,实验结果表明缺失waa L基因导致LPS无法正常合成,在检测凝胶中未形成长串的梯状条带。接着,对所构建的菌株进行生理生化特征研究,结果表明waa L的缺失对菌的生长几乎没有影响。随后,向缺失株中导入含脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)蛋白糖基化途径中糖基转移酶的表达载体,以及改构的重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)外毒素A(r EPAN29)的表达载体,使重组菌细胞内能够诱导合成以伤寒OPS为目标抗原、以r EPAN29为载体蛋白的伤寒OPS-r EPAN29糖蛋白复合物。随后对其进行了IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳以及双向电泳检验。检测结果显示,重组菌能表达伤寒OPS-r EPAN29糖蛋白复合物,且其蛋白表达谱仅存在较小差异。最后对糖蛋白复合物进行了分离纯化与免疫原性评价,ELISA测定血清抗体滴度表明,r EPAN29做为载体蛋白能有效增加糖链的免疫原性,糖蛋白比单独的多糖能诱导产生更好的免疫应答。该方法成功制备了伤寒O多糖结合疫苗,为糖蛋白疫苗的生产提供了新思路,理论上也适用于其他革兰氏阴性菌的疫苗研发。