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研究目的:
近期国内外研究显示，抗磷脂综合征(antiphospholipidsyndrome，APS)血栓形成的病理机制与血清中高滴度的抗磷脂抗体密切相关，尤其是针对β2GPI的抗体，但是有关其血栓形成的机制仍未阐明。本课题组前期研究揭示，在anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激人单核细胞株THP-1表达组织因子(tissuefactor，TF)的过程中，跨膜蛋白Toll样受体4(Toll-likereceptor4，TLR4)及其信号转导分子能够被诱导表达并参与细胞的激活作用，并且部分依赖膜联蛋白Ⅱ(AnnexinA2，ANX2)，成为抗磷脂综合征(antiphospholipidsyndrome，APS)血栓形成的机制之一。本论文重点探讨TLR4引发的信号通路中关键分子——核因子κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)和激活蛋白-1(activatorprotein，AP-1)在此过程中的作用及可能的调节机制。
研究方法:
(1)利用实时定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)检测anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞或人外周血单核细胞TFmRNA的表达，采用试剂盒检测TF活性。
(2)Westernblotting检测anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激THP-1细胞或人外周血单核细胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1表达及其磷酸化情况，并检测anti-β2GPI/β2GPI刺激的时效性和特异性。
(3)采用PDTC（NF-κB抑制剂）和姜黄素（AP-1抑制剂）预处理THP-1细胞，观察其对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF的干预作用。
(4)采用MAPKs抑制剂SB203580(p38抑制剂)、U0126(ERK1/2抑制剂)、SP600125(JNK1/2抑制剂)预处理THP-1细胞，观察其对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化的干预作用。
(5)采用TLR4特异性抑制剂TAk-242预处理THP-1细胞，观察其对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化的干预作用。
研究结果:
(1)Anti-β2GPI/β2GPI复合物（100μg/mL）能显著增加THP-1细胞及人外周血单核细胞TFmRNA水平及TF活性，与对照组比较差异显著(p＜0.05)。
(2)Anti-β2GPI/β2GPI复合物（100μg/mL）能显著增加THP-1细胞或人外周血单核细胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化水平，并显示时间效应，分别于刺激90min和60min时磷酸化最强。
(3)PDTC(20μM)和姜黄素(25μM)分别单独预处理THP-1细胞，均能明显抑制anti-β2GPI/β2GPI对TF表达的刺激效应。而两者联合使用时没有叠加效应。
(4)MAPKs抑制剂[SB203580(10μM)、U0126(5μM)、SP600125(90nM)]分别单独或者两两联合预处理THP-1细胞，单独使用时均未能显著抑制anti-β2GPI/β2GPI或LPS对NF-κBp65和c-Jun/AP-1的磷酸化;而任意两种抑制剂组合[SB203580/U0126、SB203580/SP600125、U0126/SP600125]均能显著抑制anti-β2GPI/β2GPI或LPS对NF-κBp65的磷酸化，但只有SB203580/SP600125和U0126/SP600125两组能显著抑制c-Jun/AP-1的磷酸化。
(5)TLR4抑制剂TAK-242(5μM)未能抑制anti-ββ2GPI/β2GPI对THP-1细胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化的刺激效应，但是能明显降低LPS对THP-1细胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1的磷酸化。
结论:
(1)Anti-β2GPI/β2GPI刺激单核细胞株THP-1或人外周血单核细胞后，细胞内的核转录因子NF-κB和AP-1被诱导发生磷酸化，最终促进细胞表达TF，可能是APS血栓形成的重要分子机制之一。
(2)在anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞或人外周血单核细胞表达TF所涉及的信号转导通路中，NF-κB和AP-1作为关键分子而发挥作用，TLR4及MAPKs为其上游信号分子参与调控作用，TLR4-MAPKs-NF-κB/AP-1通路可作为抗磷脂综合征(APS)血栓形成的防治靶点。
(3)NF-κB和AP-1的抑制剂能够降低anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激细胞TF的表达，这为APS血栓形成的防治提供了新思路。