【摘 要】
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丁酸梭菌是在畜禽肠道发挥肠道健康保护作用的益生菌,能作为饲料添加剂在畜牧养殖业中被广泛使用。猪源表皮生长因子（Porcine epidermal growth factor,pEGF）在猪胃肠道发挥修复损伤结肠黏膜屏障,促进胃肠道细胞增殖分化、抑制病原菌在胃肠道定植等作用的成果相继被发表。丁酸梭菌的全基因组信息已被揭示,可通利用丁酸梭菌的分泌蛋白信号肽的基因结构与功能,用丁酸梭菌同源信号肽分泌使丁
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丁酸梭菌是在畜禽肠道发挥肠道健康保护作用的益生菌,能作为饲料添加剂在畜牧养殖业中被广泛使用。猪源表皮生长因子（Porcine epidermal growth factor,pEGF）在猪胃肠道发挥修复损伤结肠黏膜屏障,促进胃肠道细胞增殖分化、抑制病原菌在胃肠道定植等作用的成果相继被发表。丁酸梭菌的全基因组信息已被揭示,可通利用丁酸梭菌的分泌蛋白信号肽的基因结构与功能,用丁酸梭菌同源信号肽分泌使丁酸梭菌分泌表达有活性的pEGF,增强丁酸梭菌制剂的应用价值。本研究以丁酸梭菌KNU/L09为载体构建能分泌表达FLAG-pEGF蛋白的重组菌,主要取得以下结果。1.信号肽分析得到了12条定位于胞外的sec/SpⅠ型蛋白,其中有10条SpⅠ型蛋白信号肽序列可成功构建含pEGF基因的重组丁酸梭菌,ESBP和NLA的蛋白信号肽预测基因片段融合pEGF融合片段构建的重组质粒后,对丁酸梭菌有致死作用。2.重组菌基因组的qPCR结果表明,除pCBP、pPD3、pPFT外,其余重组质粒在丁酸梭菌中的拷贝数均有所增加,pGHF拷贝数增加最明显,比无信号肽片段的重组质粒增加了13.1倍;其次是pPD1,提高了4倍,pPD2,pMFP,pSPP,pDBD,pCWP分别提高1.5,1,0.7,0.69,0.35倍。3.Western-Blot蛋白检测和ELISA检测结果显示,GHF、SPP、PD1和DBD的预测信号肽片段对于丁酸梭菌分泌表达猪源性EGF蛋白的效果相对较好（分泌量分别为:51.5 pg/m L;40.5 pg/m L;32 pg/m L;27.5 pg/m L）。4.KNU/pGHF、KNU/pSPP、KNU/pPD1和KNU/pDBD与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的共培养拮抗实验显示,相比丁酸梭菌,重组菌对共培养的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有不同程度的的抑制作用,KNU/pPD1对共培养金黄色葡萄球菌的生长抑制作用最明显,KNU/pSPP对共培养沙门氏菌的生长抑制作用最明显。5.IPEC-J2细胞增殖有不同程度的促进作用,KNU/pGHF:68.1%;KNU/pSPP:-33%;KNU/pPD1:45.3%;KNU/pDBD:19%。其中,KNU/pPD1、KNU/pGHF、KNU/pDBD的上清液在含量40%时对细胞的存活率促进作用最高;KNU/pSPP在100%时对细胞的存活率影响最高,达27%。综上所述,本研究通过利用丁酸梭菌的同源信号肽实现丁酸梭菌的对异源蛋白FLAG-pEGF的分泌表达,增强了重组丁酸梭菌的抑菌作用和促增殖作用,探索一种提高丁酸梭菌作为饲料添加剂应用价值的新方式。
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