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背景与目的内皮祖细胞(EPCs)在血管内皮受损时,由骨髓动员至外周血,可分化为新生单层内皮细胞,进而修复损伤的内皮。但多项研究发现EPCs能发生内皮-间质转化(End MT):在TGF-β1的诱导下,失去KDR+、CD34+、VEGF等血管内皮分子标记,转而表达α-SMA、SM22α、myocardin等间质细胞标记物,使EPCs在治疗动脉粥样硬化性疾病中的价值受到质疑。micro RNA126(mi R-126)是在内皮细胞特异性表达的一种促血管新生micro RNA。mi R-126能促进EPCs的动员、迁移、增殖,不影响EPCs的内皮分化,但mi R-126对EPCs间质转化的影响国内外未见报道。本研究拟观察mi R-126对EPCs间质转化的影响及其调节机制,为EPCs在动脉粥样硬化治疗中的作用进一步提供理论基础。方法采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后通过离体扩增培养法获得骨髓源EPCs。于倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。免疫荧光、流式细胞术及乙酰化低密度脂蛋白(Di I-Ac-LDL)和FITC标记的荆豆凝集素1(FITCUEA-1)双荧光染色等方法鉴定EPCs纯度。TGF-β1(5 ng/ml培养基)作用EPCs7天诱导EPCs的间质转化(End MT)。慢病毒转染建立mi R-126过表达EPCs。采用MTT方法检测细胞活力;细胞损伤及Transwell方法检测细胞迁移能力。慢病毒转染建立PIK3R2基因的沉默及过表达EPCs。通过荧光素酶报告系统确定PIK3R2是否为mi R-126靶基因。Fox O3 sh RNA慢病毒转染沉默Fox O3基因。采用Real-time PCR检测间质转录因子m RNA表达水平。采用Western-blot检测信号分子蛋白表达。研究mi R-126对EPCs End MT的影响及其调节机制。结果1、TGF-β1可成功诱导EPCs End MT,其mi R-126表达逐渐降低,呈时间依赖性。mi R-126过表达不影响EPCs的生长,但抑制间质转化后EPCs的增殖与迁移。2、mi R-126抑制EPCs间质细胞标记物(α-SMA、SM22α、myocardin)及间质转录因子(slug、snail、zeb1、endothelin-1)的表达,维持EPCs祖细胞标记(CD34、CD31、CD133、KDR)及成熟内皮细胞标记物(VEGF、e NOS、i NOS、Flt-1)的表达。3、荧光素酶质粒报告系统确定PIK3R2在EPCs内为mi R-126的一个靶基因。PIK3R2 sh RNA能抑制EPCs向间质细胞形态转变及间质标记物(α-SMA、SM22α)的表达。4、mi R-126抑制EPCs内SM22α的表达;PIK3R2 c DNA转染可增加EPCs胞浆内PIK3R2的表达,同时能逆转mi R-126对TGFβ1作用下EPCs胞浆内PIK3R2及SM22α表达的抑制。5、EPCs间质转化后细胞PI3K、p-Akt、p-Fox O3表达降低,而Smad3、p-Smad3和Smad4表达无明显变化,PIK3R2 sh RNA抑制EPCs内信号分子这种表达,PI3K抑制剂LY294002能逆转PIK3R2 sh RNA的作用。6、通过IGF-1激活PI3K/Akt通路,能明显增加EPCs内p-FoxO3的表达,并抑制TGF-β1诱导的SM22α的表达。但对Smad3、p-Smad和Smad 4表达无影响。7、mi R-126过表达能促进PI3K、p-Akt、p-Fox O3的表达,对p-Smad3、Smad4表达无明显影响,并被PIK3R2 c DNA所逆转。EPCs间质转化后Smad 4,Fox O3核表达增多,mi R-126抑制TGF-β1诱导下EPCs核内Smad4和Fox O3的表达。8、TGF-β1诱导EPCs间质转化后细胞p-Fox O3表达明显降低,Fox O3 sh RNA抑制EPCs中Fox O3的表达;同时,Fox O3 sh RNA抑制TGF-β1诱导的SM22α表达。结论EPCs的间质转化与TGF-β1作用下的PI3K/Akt-FoxO3信号通路相关。mi R-126过表达能抑制TGF-β1对EPCs诱导的间质转化,其机制是通过靶基因PIK3R2,增加PI3K/Akt磷酸化水平,促进Fox O3磷酸化(抑制其作用),并可能抑制TGF-β1诱导下Smad 4的核转移,从而抑制EPCs的End MT。