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腭裂是人类最常见的颅颌面部发育缺陷,我国腭裂患者居多,且发病率高。通常认为是由于基因或环境因素导致上腭板发育异常造成的疾病。腭裂的发生会造成患者讲话,进食,听觉等功能障碍。腭裂分为多种类型,包括单纯性腭裂,唇裂伴或不伴腭裂,悬雍垂裂,黏膜下腭裂,完全型腭裂,不完全型腭裂,腭裂的类型不同其发生的分子机制不同。由于小鼠与人的上腭板发育过程具有相同的模式,而且小鼠和人基因同源性高达99%,因此,目前探究人腭裂发生的分子机制主要以遗传修饰小鼠为动物模型。上腭板的发育过程复杂且精细,在上腭板融合之前,上腭板的前后端组织的基因就呈现出差异性,上腭板融合之后,上腭板前端间充质细胞分化为成骨细胞,形成硬腭;而后端则分化形成肌肉组织,形成软腭。目前已知有很多基因分别在上腭板的前后端特异性表达,例如Msx1,Bmp4,Bmp2,Shh,Spry2,Fgf10,Fgf7,Shox2等在上腭板前端发育过程中特异性表达,Meox2,Tbx22,Mn1,Barx1在上腭板后端发育过程中特异性表达。这些基因在上腭板的前后端模式化分化成为硬腭和软腭过程中发挥了重要作用。Shox2是一个同源异型结构域(homeodomian)家族成员,在小鼠的上腭前端,心脏的窦房结以及肢芽的后端特异性表达,是组织特异性表达的转录因子。目前,转录因子在组织、器官特异性表达从而调控其发育过程正成为发育生物学研究的热点。组织特异性转录因子能结合到特定的增强子上调控下游的基因信号通路,从而调控细胞分化过程,决定器官的模式形成。课题组前期利用Shox2HA-DsRed(将HA标签蛋白插入到Shox2翻译起始位点之后,使得表达出的Shox2蛋白带有HA标签蛋白)小鼠的肢芽进行ChIP-Seq分析,确定Shox2是能与肢芽发育相关的增强子序列结合从而调控与肢芽模式化发育相关基因的表达的转录因子,但Shox2在上腭板中作为转录因子如何调控上腭板模式化发育还未阐明,本研究将对Shox2HA-DsRed小鼠的上腭板组织进行ChIP-Seq分析,解析在上腭板发育过程中与Shox2结合的上腭板组织特异性增强子序列,并通过转基因小鼠验证其活性。另一方面还将利用Shox2cre/+小鼠和ATAC-Seq技术,解析Shox2+谱系的间充质细胞在成骨分化过程中的染色质开放区,结合RNA-Seq的差异基因表达谱,筛选出Shox2在上腭板前端间充质细胞成骨分化过程中直接调控的靶基因。本研究将为研究人类腭裂疾病的预防及治疗奠定基础。首先,为了探究Shox2在小鼠上腭板融合之前的转录因子特性,我们分别利用ChIP级HA和H3K27ac抗体对E12.5 Shox2HA-DsRed小鼠(该小鼠的Shox2蛋白正常表达且带有HA蛋白标签,并且在表达Shox2基因的细胞中带有红色荧光)的上腭板前端(红色荧光)及后端(不表达红色荧光)组织进行ChIP-Seq实验。测序数据的分析结果表明,Shox2在基因组上的结合位点富集在一些在上腭板前端特异性表达的基因(如Msx1)转录起始位点30Kbp-100Kbp附近,表明Shox2作为关键的转录因子与上腭板前端特异性增强子结合决定了上腭板前后端组织的发育。之后我们在全基因组范围内从Shox2在基因组上特异性结合位点中筛选出一段在Meis1基因的35Kbp附近可能的活性增强子序列,将其克隆到增强子活性报告质粒Hsp68-LacZ上,并通过显微注射收获Meis1-enhancer-Hsp68-LacZ转基因小鼠进行增强子活性分析。通过观察E12.5 Meis1-enhancer-Hsp68-LacZ小鼠胚胎X-Gal染色结果及组织切片伊红染色结果发现该转基因小鼠的上腭板前端间充质细胞中呈现特异性X-Gal显色,表明该增强子序列是一个上腭板前端组织特异性活性增强子。其次,为探究Shox2在上腭板融合后间充质细胞的成骨分化过程中发挥的调控机制,首先收取E14.5,E15.5,E16.5 Shox2Cre/+;Nkx2.5F/F;R26RmTmG小鼠与Shox2Cre/-;Nkx2.5F/F;R26RmTmG小鼠胚胎,进行组织切片的Runx2和GFP抗体免疫荧光共定位实验,发现完全敲除Shox2后上颌骨腭突前端成骨细胞明显减少,证明Shox2参与上腭板前端间充质细胞成骨分化的过程。进一步为了解析Shox2作为转录因子在上腭板间充质细胞的成骨分化过程中对染色质开放区的调控,我们通过流式分选了E14.5 Shox2Cre/+;Nkx2.5F/F;R26RmTmG小鼠和Shox2Cre/-;Nkx2.5F/F;R26RmTmG小鼠中Shox2正常表达的细胞(WT)和Shox2敲除的细胞(MT)进行ATAC-Seq分析,发现Shox2完全敲除后,有530个原本处于开放状态的染色质开放区关闭。为了解析Shox2调控的直接靶基因,我们将Shox2敲除后关闭和开放的染色质区域进行注释,找出差异区域50Kbp内的基因,并且将这些基因与Shox2敲除后的RNA-Seq得到的差异基因进行共分析,筛选出一批在Shox2敲除后基因表达量呈现差异,同时在该基因的转录起始位点附近50Kbp的区域内,在Shox2敲除后的染色质开放区发生变化,这些基因即为Shox2所直接调控的靶基因,从中我们挑选出Alk3,Alk5,Col2a1,Dlx2,Smoc1五个基因,通过实时荧光定量PCR验证了当Shox2完全敲除后,这五个基因表达量均呈现不同程度减少。并且这些基因的GO功能注释的聚类分析显示它们与模式化形成、成骨分化、胚胎细胞发育等生物学过程密切相关,表明转录因子Shox2通过调控相关成骨分化基因的染色质开放状态进而调控基因的表达。综上所述,我们证明了转录因子Shox2是通过与上腭板前端组织特异性增强子结合参与小鼠上腭板模式化发育过程,并通过Shox2的ChIP-Seq数据筛选到1个上腭板前端组织特异性的增强子。同时利用Shox2敲除小鼠模型的ATAC-Seq数据和RNA-Seq共同结合分析,筛选出Shox2直接调控上腭板间充质细胞成骨分化过程中相关靶基因。这对于理解Shox2在小鼠上腭板的前后端模式形成和上腭板的膜内骨化过程中的功能具有重要意义。