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背景多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一种主要以中枢神经系统损伤为主的自身免疫和神经退行性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是目前MS研究中最为广泛使用的动物模型。最近研究发现干细胞具有免疫调节作用使其在自身免疫性疾病的治疗中凸显出独特的应用价值。由于经血源性子宫内膜干细胞（Menstrual blood-derived endometrial stem cells,MenSCs）具有免疫原性低、容易从单一供体获得大量性状均一的供体细胞等独特优点,所以本研究采用MenSCs对小鼠EAE进行治疗研究。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是细胞参与非特异性免疫的一类重要的受体分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。有研究表明间充质干细胞的免疫调节作用不是一成不变的,在炎症微环境中,它可以发挥抑炎作用,而在非炎性微环境中,它也会表现出促炎的一面,且其免疫调节作用的变化可能通过其表面不同的TLRs进行调节。本课题旨在探究不同TLRs激动剂刺激对MenSCs的免疫调节特性的影响,以期构建一种不会被炎症微环境中免疫激活因子激活其促炎反应,而仍具有很好的免疫调节作用的MenSCs,并探究其对小鼠EAE移植治疗中的作用机制,为最终应用于MS等自身免疫性疾病的临床治疗奠定基础。目的1.探究MenSCs移植治疗小鼠EAE的效果及作用机制;2.探究不同TLRs激动剂刺激后,MenSCs免疫调节特性的变化;及其对EAE小鼠的治疗作用变化及机制;3.探究过表达或基因敲除TLRs的MenSCs对EAE小鼠的治疗作用。方法1.从新鲜的经血样本里提取MenSCs,对其进行扩增培养和鉴定,以满足后续实验的需要;2.小鼠EAE模型的构建:通过皮下注射MOG35-55(Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55,MOG35-55)和含有灭活结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂乳化液（Complete Freunds adjuvant,CFA）,注射当天记为day 0,在day 0和day 2分别通过尾静脉注射相同剂量的百日咳毒素（Pertussis toxin,PTX）;3.在MenSCs的培养基中分别加入不同的TLRs激动剂,分别提取总RNA和收集培养液上清,采用qPCR和Bio-Plex技术检测MenSCs基因表达和蛋白分泌的变化;4.利用慢病毒侵染的方法构建过表达人TLR4的MenSCs,培养一周后,利用qPCR和流式细胞术检测构建的MenSCTLR4细胞中TLR4基因的表达情况;5.采用尾静脉注射的方式移植MenSCTLR4细胞,并根据EAE评分标准对小鼠进行每日疾病评分;6.在细胞移植后不同时间点分别从小鼠的脾脏和淋巴结中提取免疫细胞,并进行抗体染色,利用流式细胞仪进行检测鉴定。结果1.从经血中提取出的MenSCs符合间充质干细胞的鉴定标准,通过尾静脉移植后,能显著抑制EAE小鼠抗原提呈细胞的激活,并显著降低EAE小鼠的疾病严重程度;2.qPCR和Bio-Plex的结果显示,不同TLRs激动剂刺激MenSCs均能改变其免疫调节特性,使MenSCs中一些细胞因子的基因表达和胞外分泌水平显著升高;3.不同处理的MenSCs对EAE小鼠均有一定的治疗作用,在发病高峰期可以显著降低EAE小鼠的每日疾病评分,但与未刺激的MenSCs相比,Pam3-MenSCs的治疗作用明显减弱,LPS与Poly（I:C）激动剂刺激的MenSCs具有与未刺激MenSCs几乎一致的治疗效果。MenSCs可以显著降低EAE小鼠的累积评分,LPS-MenSCs移植组EAE小鼠的累计评分高于MenSCs组,Pam3-MenSCs和poly（I:C）-MenSCs移植组EAE小鼠累积评与MenSCs组无显著差异;4.流式细胞术检测结果显示,MenSCs移植可以降低EAE小鼠淋巴结和脾脏中活化的CD4+T细胞、Th1细胞和Th17细胞的数量和百分比,移植经TLRs激动剂刺激的MenSCs的小鼠,其淋巴结和脾脏中活化的CD4+T细胞、Th1细胞和Th17细胞的数量和百分比较移植未刺激的MenSCs组小鼠均升高;5.通过qPCR和流式细胞术检测证实,本研究成功构建了过表达TLR4的MenSCs,通过流式细胞术对MenSCTLR4的表面干细胞Marker进行鉴定,其仍符合间充质干细胞的鉴定标准。MenSCTLR4相较于MenSCpCDH,对EAE小鼠的治疗作用减弱。结论1.MenSCs移植对小鼠EAE有治疗作用,且这种治疗作用与其对EAE小鼠脾脏中抗原提呈细胞的激活抑制有关;2.用TLR2/3/4的激动剂刺激MenSCs,能使其炎症相关细胞因子的表达水平升高,在EAE小鼠体内的免疫调节作用向促炎方向发生改变,对EAE小鼠的治疗作用减弱;3.过表达TLR4的MenSCTLR4相较于空载体病毒侵染的MenSCpCDH,对EAE的治疗作用减弱。