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TNF-α是具有广泛生物学效应的细胞因子，在体内以两种形式存在：即17kD的分泌型TNF-α和26kD的跨膜型TNF-α。两型TNF的杀瘤效应不同，TM-TNF主要诱导肿瘤细胞凋亡，尽管S-TNF也可导致肿瘤细胞凋亡，但其诱导的坏死率常高于凋亡率。二型TNF均通过与TNFR结合发挥效应，但诱导同一靶细胞死亡方式却明显不同，二者启动的胞内信号分子及诱导基因表达均可能存在差异。
本室前期工作就二者诱导的差异基因之一EST3进行全长基因延伸、克隆、表达和多克隆抗体的制备，初步检测并证实了EST3定位于细胞核，表达于人PBMC，多种细胞系，肺，胎盘，小肠组织中。初步功能检测证实与TNF的杀伤功能有关。
本实验主要通过基因工程技术将该基因与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)连在一起，获得EST3-EGFP融合蛋白，以便进一步研究其表达和定位。主要结果如下：
一、pTriEx-EST3-EGFP构建、克隆及鉴定
以pTriEx-EST3及pEGFP-N1为模板，用PCR扩增EST3和EGFPcDNA片段，重叠延伸PCR扩增EST3-EGFP融合基因，BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切EST3-EGFP融合基因和pTriEx-4，并用T4DNA连接酶连接，获得pTriEx-EST3-EGFP重组体。将其转化DH5α感受态细菌，获得Amp抗性的阳性菌落。以菌体PCR初步筛选阳性克隆；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ双酶切鉴定，显示有1.4kb及6.5kb两片段，分别与EST3-EGFP连接片段与空载体大小一致；进一步DNA测序分析证实此重组体包含编码去除终止密码子后的EST3全部编码序列及EGFP全长编码序列，没有突变和移码，提示EST3-EGFP融合蛋白的穿梭质粒已构建成功。
二、融合蛋白在原核细胞中的表达
以重组体转化Rosetta(De3)pLacI感受态细菌，获得Amp和Cam双抗性的表达菌。IPTG诱导表达EST3-EGFP融合蛋白，用10％SDS-PAGE分析，可观察到分子量为57.8kD条带从诱导后2h开始出现，6h表达最强。由于表达载体在起始密码之后有6个组氨酸和一些酶切位点，可编码含有55个氨基酸的产物，其分子量约为6kD，加上25.5kD的EST3蛋白，26.3kD的EGFP蛋白，理论值为57.8kD。经扫描分析，蛋白质表达量占菌体蛋白总量的40％。用免疫印记证实57.8kD的分子可与抗EST3特异性抗体结合，而荧光显微镜证明细菌表达的融合蛋白中的EGFP可在菌体中发出绿色荧光，上述证据提示EST3-EGFP融合蛋白在原核细胞中被成功表达。
本实验成功构建了pTriEx-EST3-EGFP重组体，并在原核细胞中表达57.8kD的EST3-EGFP融合蛋白，为进一步探索EST3的功能、定位及其与其他分子间的相互作用提供了一个有效的检测手段与实验工具。