论文部分内容阅读
由△6脂肪酸脱氢酶催化生成的γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid, GLA,C18:3△6,9,12)是动物必需的不饱和脂肪酸。牧草饲料是反刍动物营养的主要来源,提高牧草中GLA水平对家畜健康及其产品品质具有重要价值。微孔草(Microula sikkimensis)是我国西部高海拔地区特有的野生资源,被誉为GLA的新油源。目前对微孔草A6脂肪酸脱氢酶基因(MsD6DES)及其受环境因子调控的研究尚未见报道。本研究以微孔草为材料,克隆A6脂肪酸脱氢酶基因、转化烟草验证其功能;研究温度、渗透胁迫和机械损伤对MsD6DES基因表达的调控及其对脂肪酸组成的影响;并对GLA除了作为膜脂组成外的其它作用进行初步探索,以期为牧草品质改良提供优异的基因资源,为深入了解△6脂肪酸脱氢酶基因及其催化产物GLA对外界刺激的应答机制奠定基础。主要结果如下:(1) Ms6DES全长1713bp,开放阅读框(ORF) 1344bp,编码448个氨基酸,含有三个保守的组氨酸富集区,N-末端含有一个类似于细胞色素b5的血红素结合区(HPGG)。其与已知植物的△6脂肪酸脱氢酶同源性均在60%以上,与同科植物的同源性>80%。(2) MsDDES基因在微孔草种子中的表达量最高,其次是幼叶,在老叶、根和茎中表达量相对较低。(3)将MsD6DES基因转化烟草,该基因能利用烟草内源亚油酸(Linoleic acid,LA,C18:2△9,12)和 a-亚麻酸(a-Linolenic acid, ALA,18:3△9,12,15)分别合成 GLA和十八碳四烯酸(Octadecatetraenoicacid,OTA, 18:4A6,9,12,15),其占总脂肪酸的1.2%和1.6%,转化效率为8.4%和3.4%,表明MsD6DES可能更偏好于ω6底物LA。(4)低温胁迫下,微孔草叶片不饱和脂肪酸含量增加,饱和脂肪酸含量降低;在高温胁迫下趋势相反;GLA含量变化均呈单峰曲线。MsD6DES基因的表达更易被低温诱导,其在低温下表达量更高、出现峰值的时间也更早。低温、高温均在转录水平调控MsD6DES基因的表达,但高温可能通过转录和转录后水平共同介导细胞内GLA含量的变化。(5)渗透胁迫下,脂肪酸组成在处理前后无显著变化。渗透胁迫在转录水平调控MsD6DES基因的表达,但可能主要在转录后水平介导胞内GLA含量的变化。(6)机械损伤后6 h,信号分子茉莉酸(Jasmonate, JA)的前体LA和ALA含量增加,而GLA和OTA含量降低,表明伤胁迫激活了 JA合成途径而抑制了脂肪酸合成途径。机械损伤诱导了MsD6DE 基因的表达,其催化产物GLA在处理12 h有一定累积,GLA及其合成关键基因MsD6DES可能参与微孔草对机械损伤的防御反应。(7) GLA、ALA和茉莉酸甲酯(Methyljasmonate, MeJA)均能引起“氧化迸发”,可能作为一种激发子诱导了植物对外界生物与非生物胁迫的响应。GLA不能诱导微孔草叶片蛋白酶抑制剂活性的变化,GLA可能不是JA合成的前体物质。