第一部分Leber遗传性视神经病变患者筛查及资料收集　　 目的：　　 1、在全国范围内收集视神经萎缩家系,建立临床资料和分子遗传学资料数据库。并收集104个无血缘关系的正常人作为对照。　　 2、在收集的家系(视神经萎缩家系和正常对照者)中检测与Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)相关的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)3个原发突变位点(ND1 G3460A、ND4G11778A、ND6 T14484C),了解是否在中国人群中存在及统计突变发病频谱。　　 方法：　　 1、通过温州医学院眼视光医院、北京中医药大学东方医院眼科、中国中医科学院眼科医院、河北邢台眼科医院和福建医科大学附属第一医院合作,建立视神经病萎缩系收集网络,另外还有全国其他医院送来的少量家系资料。经温州医学院伦理道德委员会的许可,病人和所有受试者同意,签署知情同意书,采集外周静脉血样,收集临床资料和家系资料。　　 2、对所有受试者进行详细的眼科临床检查,包括标准对数视力表检测视力,俞自萍色觉图检查,Humphrey视野计按程序SITA检查(Humphrey VisualField AnalyzelⅡi,SITA Standard),德国罗兰电生理仪(Roland Consult RETIport gamma,pattern or flash VEP)检查视觉诱发电位(VEP)以及佳能眼底数码彩照(Canon CR6-45NM fundus camera)拍摄眼底。　　 3、对采集的血样提取基因组DNA,并设计3对包含3个原发突变位点的引物进行PCR扩增、纯化和测序。　　 4、使用生物软件包括DNAStar、Chromas、Clustal X等对测序结果进行分析,查找线粒体基因组突变位点,结合临床资料分析其对LHON表型表达的影响。　　 结果：　　 1、从2008年1月起,我们共收集了338个视神经萎缩家系,检测到携带LHON3个原发突变位点的家系共158个,其中G11778A突变家系137个、G3460A突变家系7个、T14484C突变家系14个。　　 2、通过对3个原发位点的筛查还发现携带继发突变位点包括G3316A、T3394C、C3497T、G3635A、G11696A、T14502C、A14693G突变的家系共46个,其中携带A14693G突变的家系4个。　　 3、在104例正常对照者中只有1例携带A14693G突变。　　 结论：　　 1、3个原发突变位点(ND1 G3460A、ND4 G11778A、ND6 T14484C)的发病频谱与白种人相比有所差异,其中G11778A突变比例较高,而G3460A和T14484C突变所占比例较低。　　 2、共收集到携带tRNAGluA14693G突变的家系4个,其中携带ND6 T14484C和tRNAGluA14693G双突变位点的家系1个,仅携带tRNAGluA14693G突变位点的家系3个,为分析线粒体tRNAGluA14693G突变对LHON表型表达的影响提供遗传资料基础。　　 第二部分线粒体tRNAGluA14693G突变可能影响Leber　　 遗传性视神经病变家系的表型表达　　 目的：　　 1、通过了解携带线粒体tRNAGluA14693G突变的4个中国LHON家系的临床表型、外显率和表现度,分析A14693G突变对LHON表型表达的影响。　　 2、对线粒体全序列进行扩增,分析继发位点、核修饰基因、环境因素等其他因素对中国LHON家系外显率和表现度的影响。　　 方法：　　 1、对4个中国汉族LHON家系先证者及其他母系成员进行详细的眼科临床检查,采集外周静脉血样,收集临床资料和家系资料。　　 2、用常规的苯酚-氯仿法提取线粒体基因组DNA并以其为模板,使用24对有部分重叠的引物对先证者及其他母系成员的mtDNA全序列进行PCR扩增、纯化和测序。　　 3、使用生物软件包括DNAStar、Chromas、Clustal X等对测序结果进行分析,查找线粒体基因组突变位点,结合所收集的临床资料分析其对功能的影响。　　 结果：　　 1、这4个家系都具有典型的LHON临床特征,其中仅携带A14693G突变的WZ201、WZ202和WZ203家系中外显率都较低,分别为6.7％、15.8％和7.1％,发病年龄从1岁到16岁不等,平均发病年龄为9岁,视力损伤程度均为轻度。携带A14693G和T14484C双突变的WZ204家系外显率为44.4％,家系成员发病年龄从14岁到40岁不等,男女发病比例为3:1(3个男性,1个女性)。　　 2、对先证者及其他母系成员线粒体全基因组进行测序分析发现这4个家系都存在大量的mtDNA变异位点,但4个家系先证者和其他母系成员均携带tRNAGluA14693G同质性突变。其中,WZ201、WZ202和WZ203家系不携带ND6 T14484C原发突变位点,WZ204家系还携带T14484C原发突变。104例正常对照者中只有1例携带A14693G突变。　　 3、线粒体DNA单体型分析发现这4个家系的mtDNA序列分别属于亚洲单体型Y1b、Y1、Y1和Y1,没发现其他影响功能的位点存在。　　 结论：　　 1、3个仅携带线粒体tRNAGluA14693G突变的LHON家系(编号为WZ201、WZ202和WZ203)外显率均较低,而携带线粒体A14693G和T14484C双突变的LHON家系(编号为WZ204)外显率较高(44.4％),且在104例正常对照者中只有1例携带A14693G突变,均提示T14484C突变是其主要的致病因素,而A14693G突变本身不足以导致LHON的发生,可能协同原发突变位点T14484C提高LHON的外显率。　　 2、对线粒体全基因组分析,发现4个LHON家系(编号分别为WZ201、WZ202、WZ203和WZZ204)均携带tRNAGluA14693G同质性突变,A14693G突变位于线粒体tRNAGlu的高度保守区(通用位点为54位),可能导致tRNA空间结构和稳定性发生改变,进而可能引起视力损害方面的线粒体功能障碍。　　 3、线粒体单体型分析发现4个家系的mtDNA序列分别属于亚洲单体型Y1b、Y1、Y1和Y1,但4个家系的线粒体全基因中不携带其他高度保守和有功能意义的突变位点,提示线粒体单体型特有的多态性位点可能对携带A14693G突变的4个LHON家系发病不起重要作用。　　 4、家系先证者及其母系成员尽管携带有相同的突变位点,但发病年龄和病情严重程度存在差异,表明核修饰基因、环境因素等可能影响LHON的表型表达。