胞磷胆碱作为一种可以治疗多种神经系统疾病的药物,在临床上有广泛的应用,展现了良好的安全性和有效性。由于化学法合成会涉及有毒试剂的使用且底物转化率较低,目前主要使用生物法进行合成。受限于关键底物的穿膜效率,胞磷胆碱的生物合成主要采用两步法,首先大量培养并富集微生物细胞,通过冻存处理提高细胞膜的通透性或者直接超声处理使细胞裂解,然后加入底物进行生物催化反应。这一生产过程工艺复杂、且耗时耗力。胞磷胆碱的合成是耗能反应,ATP的供应是决定其产能的关键因素之一。然而,被冻存或裂解处理过的细胞已经几乎不具备ATP的合成能力,无法持续为胞磷胆碱合成提供足够的能量,导致反应过程往往需要添加供能底物,使生产工艺更加复杂且成本进一步提高。因此,有必要寻找优质生产宿主,开发新型生产工艺,为胞磷胆碱的生产应用提供更为便捷和高效的策略和方法。毕赤酵母是一种应用广泛的真核表达宿主,具有培养成本低、表达量高、增殖迅速、培养密度高、糖基化温和等优点,而且已经被美国食品和药物管理局认定为一般安全菌株,可被用于食品和医药领域。目前,毕赤酵母表达系统在蛋白的表达和小分子化合物的生产中都有广泛的研究和应用,展现了其作为优质底盘宿主的应用潜力。本课题即以毕赤酵母作为底盘细胞,通过代谢工程改造和工艺优化,实现在毕赤酵母细胞中通过活细胞发酵合成胞磷胆碱,为胞磷胆碱的工业生产提供新型工艺和生产策略。首先,在毕赤酵母中通过过表达胆碱激酶Cki和磷酸胆碱胞苷转移酶Cct,有效提升了胞磷胆碱的产量。然后,通过过表达酿酒酵母来源的胆碱转运蛋白Hnm1,增强了细胞对胆碱底物的转运功能,进一步提升了胞磷胆碱的合成能力。接着,使用不同强度的启动子组合表达三种蛋白,对三个蛋白的表达量进行了平衡优化,最后实现在以磷酸胆碱为底物时,菌株的胞磷胆碱产量最高达到2.3 g/L,为野生型菌株的56倍,初步建立了活细胞发酵法合成胞磷胆碱的生产工艺。胞磷胆碱为耗能产物,细胞内ATP的供应对于CDP-胆碱的合成至关重要。为了进一步提升胞磷胆碱的产量,对毕赤酵母的能量代谢网络进行了改造。通过添加能源底物柠檬酸钠,有效提升了胞内的ATP水平,使胞磷胆碱的合成显著增强。通过缺失糖原分支酶阻断了糖原合成途径,但是发现这对产物的合成没有积极影响。ATP合成酶sATP6和氧传递蛋白sVHb的过表达均可以有效提升胞磷胆碱的产量。其中,ATP合成酶sATP6的过表达对于菌株合成能力的提升更为显著,可使胞磷胆碱产量最高达到6.0 g/L,为野生型菌株的88倍,对于底物CMP的转化效率达到40%。对胞磷胆碱关键底物CTP的合成途径进行了改造,分别尝试阻断CMP的支路消耗途径,并增强了 CTP的从头合成途径。CMP消耗途径中的两个酶5’-NT和Cda敲除后,菌株的胞磷胆碱产量和对于底物的摩尔得率均有进一步提升。在此基础上,对敲除5’-NT和Cda后得到的菌株分别进行了 CMP和磷酸胆碱两种底物的添加浓度优化,得到CMP和磷酸胆碱的最优添加浓度分别为18 g/L和15 g/L,此时胞磷胆碱产量最高达到29.7 g/L,为野生型菌株的436倍,对底物CMP和磷酸胆碱的摩尔得率分别为84.7%和61.7%。综上所述,本研究通过毕赤酵母的代谢工程改造和工艺条件优化,实现了活细胞一步发酵合成胞磷胆碱,得到了较高的产量和较高的底物摩尔得率,简化了生产工艺,并展现了一定的工业应用潜力。与目前的工业合成策略相比,毕赤酵母活细胞一步发酵合成胞磷胆碱是一种新型的、具有竞争力的胞磷胆碱生产模式,为胞磷胆碱的生产提供了新的技术路线。