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目的
糖尿病是一种因胰岛β细胞数量减少或功能缺陷而致胰岛素绝对或相对缺乏引起的以糖代谢紊乱为主要临床表现的代谢性疾病。目前全世界糖尿病人数有2.23亿,据WHO推测到2025年将增加到3.33亿。目前的降糖药物和胰岛素注射治疗尚不能根治糖尿病,晚期高血糖症所带来的慢性并发症如肾病、神经系统疾病、视网膜病变以及心血管系统病变等大大降低了患者的生活质量甚至威胁生命。胰岛移植是治疗1型和部分2型糖尿病重症患者的有效方法之一,但供体来源的严重不足限制了其应用。干细胞移植是目前治疗糖尿病的一条新途径,其将会为糖尿病患者带来新的曙光。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为干细胞治疗的重要细胞来源,具有取材简单方便、易于体外培养扩增、易于基因修饰等优点,诱导患者自身MSCs产生的胰岛细胞进行移植,可以避免排斥反应,具有非常好的临床应用前景。
胰腺的发育是相关基因时空特异性表达的结果,胰岛细胞的分化成熟受众多转录因子调控,这些转录因子中即包括具有正向调节作用的转录激活因子(如Pdx1、Ngn3、NeuroD1、MafA等),也有负向调节作用的转录抑制因子(如REST/NRSF、SHH等)。通过基因敲除和转基因动物的表型观察发现,这些转录因子的表达是按照一定的层级模式进行的。去除胰岛细胞分化的抑制性因素并表达促进因素很有可能是MSCs遵循胰岛β细胞早期发育规律,分化为胰岛β细胞的基本条件。
由此,在本实验中我们构建了shREST/NRSF、shSHH、Pdx1、Ngn3、NeuroD1的慢病毒表达载体,并将其不同组合共转染MSCs,观察其重编程MSCs分化为胰岛素分泌细胞的能力,确定最佳的重编程方案,并对重编程结果进行RNA-Seq分析,比较MSCs在向胰岛素分泌细胞分化过程中特异性基因的表达异同、发现MSCs向胰岛素分泌细胞分化过程中相关的已知及未知编码基因、筛选出起支配作用的基因。
方法
一、慢病毒表达载体的构建
(一)细胞培养
(二)siRNA设计
(三)目的基因Pdx1、Ngn3、NeuroD1片段的制备
(四)慢病毒载体酶切:
1、使用HpaI和XhoI酶切pFU-GW-iRNA载体以使其线性化;
2、使用AgeI酶切pFU-FU载体以使其线性化。
(五)感受态制备
(六)连接
(七)转化:
1、shREST/2qRSF、shSHH载体的转化;
2、Pdx1、Ngn3和NeuroD1过表达载体的转化。
(八)阳性克隆的PCR鉴定
(九)Western blot方法检测Pdx1、Ngn3和NeuroD1质粒在293T细胞中的表达
(十)质粒大量抽提
(十一)慢病毒包装:慢病毒载体与包装质粒共转染293T细胞。
(十二)病毒的收获及浓缩
(十三)Lentivirus滴度测定:
1、逐孔稀释法测定滴度;
2、Realtime定量PCR法测定滴度。
二、重编程诱导大鼠骨髓MSCs分化为胰岛素分泌细胞
(一)大鼠骨髓MSCs的分离和培养;
(二)MSCs传代;
(三)MSCs的流式细胞鉴定;
(四)慢病毒转染MSCs,确定最佳感染MOI;
(五)慢病毒转染重编程MSCs分化为胰岛素分泌细胞:
(六)实时定量荧光PCR检测MSCs慢病毒转染效率及相关分化基因的表达;
(七)免疫细胞化学与免疫荧光法鉴定;
(八)免疫电镜样本制备及观察;
(九)ELISA法检测分泌胰岛素;
(十)统计学分析。
三、RNA-Seq比较胰岛素分泌细胞与MSCs差别
(一)慢病毒转染大鼠骨髓MSCs
(二)总RNA抽提
(三)RNA-Seq测序实验流程
1、Total RNA的检测;
2、mRNA的纯化;
3、反转录第一链的合成;
4、反转录第二链的合成;
5、末端修复;
6、3末端加A;
7、加Adapter;
8、连接产物的胶回收纯化;
9、PCR;
10、PCR产物的胶回收纯化;
11、RNA-Seq文库测序。
(四)标准信息分析
1、标准信息分析流程;
2、原始序列数据;
3、去除杂质数据;
4、Clean Reads数据;
5、与参考序列比对;
6、测序评估;
7、基因表达量统计;
8、差异表达基因筛选;
9、Gene Ontology功能显著性富集分析;
10、Pathway显著性富集分析;
11、Real time PCR检测RNA-Seq分析相关差异基因的表达。
结果
一、成功构建shREST/NRSF、shSHH、Pdx1、Ngn3和NeuroD1慢病毒表达载体。
二、重编程诱导大鼠骨髓MSCs分化为胰岛素分泌细胞
(一)成功分离培养出大鼠骨髓MSCs
(二)MSCs细胞表面抗原标志流式细胞学鉴定显示,不表达造血细胞和内皮细胞的典型标志分子CD34、CD45和CD14,其细胞表面主要表达间质细胞表面分子CD73、CD44和CD90。
(三)慢病毒转染MSCs,当MOI值为80时,感染效率几乎为100%。
(四)构建的4个shREST/NRSF和3个shSHH慢病毒表达载体转染MSCs后,能使其相应的目的基因REST/NRSF和SHH的表达呈不同程度的降低,其中shREST/NRSF-3#和shSHH-1#干扰效率最明显,因而选择这两个靶点进行慢病毒的大量包装。
(五)Pdx1、Ngn3和NeuroD1慢病毒表达载体转染MSCs后,其表达都明显升高。
(六)shREST/NRSF、shSHH、Pdx1、Ngn3和NeuroD1慢病毒表达载体不同组合转染MSCs,胰岛素基因的表达以shREST/NRSF+Pdx1+Ngn3,shREST/NRSF+shSHH+Pdx1,Pdx1+Ngn3+NeuroD1和Pdx1+Ngn3升高较为明显,其中又以Pdx1+Ngn3组最高。
(七)Pdx1+Ngn3共转染组细胞形态发生明显改变。
(八)ELISA法检测Pdx1+Ngn3共转染组胰岛素的分泌量明显升高。
(九)Pdx1+Ngn3共转染组胰岛分化相关基因的表达有不同程度的升高。
(十)免疫荧光观察到insulin、Glucagon、Somatostatin三种激素的表达。
三、RNA-Seq分析显示,重编程后的胰岛素分泌细胞与MSCs基因表达差异显著
(一)RNA-Seq分析显示,与阴性对照组相比共有1476个基因的表达升高,849个基因的表达降低。
(二)Gene Ontology功能及Pathway显著性富集初步分析显示,在与胰腺发育和胰岛素分泌调控密切相关的基因中,共有23个基因表达上调,5个基因表达下调。
(三)Real time PCR检测进一步证实了RNA-Seq分析结果。
结论
通过重编程成功诱导大鼠骨髓MSCs分化为胰岛素分泌细胞。