腈水合酶是一种可以催化腈类化合物转化成相应酰胺类化合物的金属酶,在生物有机合成,及环境治理方面得到广泛运用,最为成功的例子是用于工业化生产丙烯酸胺。论文纯化了Rhodococcus boritolerans FW815腈水合酶,研究了R.boritolerans FW815腈水合酶酶学特性;最后,考察了R.boritoleransFW815全细胞催化2-氧代-1-吡咯烷基丁腈生物水合工艺,构建了R.boritolerans FW815全细胞催化2,2-二甲基环丙甲腈两相水合工艺。R.boritolerans FW815细胞经超声破碎后,细胞提取液经High Q阴离子交换层析、丁基疏水作用层析、UNO Q整体柱层析分离获得电泳纯腈水合酶。得到纯酶的比酶活为918.4 U/mg,酶活收率为14%。基于SDS-PAGE结果,发现该酶由两个亚基组成,分子量分别为24 kD和22 kD。分析型分子排阻层析分析揭示,该酶腈水合酶分子量计算值为40.4 kD。R.boritolerans FW815腈水合酶为异二聚体。利用纯化的腈水合酶为材料,系统研究了R.boritolerans FW815腈水合酶酶学特性。结果表明,R.boritoleransFW815腈水合酶最适反应pH值为7.0,最适反应温度37℃。在pH为7.0时,该酶的稳定性最好。该酶表现出的热稳定性并不理想,30～40℃下,酶的半衰期仅为1h左右。EDTA抑制R.boritolerans FW815腈水合酶活性,这与其为金属酶有关;Co2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+离子抑制R.boritoleransFW815腈水合酶活性,而Fe2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等则表现出一定程度上的激活作用。在经EDTA处理后酶液中加入不同浓度的Fe2+、Fe3+、CO2+、Cu2+、Zn2+等金属离子,未发现酶复活现象。以DMCPCN为底物,R.boritolerans FW815腈水合酶动力学常数Km和Vmax、分别为 0.293 mmol/L 和 209.6 μmol/(min·mL)。除 2,2-二甲基环丙甲腈、2-氨基-2,3-二甲基丁腈之外,R.boritolerans FW815腈水合酶对2-氧代-1-吡咯烷基丁腈、丙烯腈、2-氨基-4-甲硫基丁腈也表现出腈水合活性,该酶对四种腈化合物的催化效率强弱顺序为2,2-二甲基环丙甲腈>丙烯腈>2-氨基4-甲硫基丁腈>2-氧代-1-吡咯烷基丁腈,2,2-二甲基环丙甲腈是最适作用底物,该腈水合酶对2-氧代-1-吡咯烷基丁腈的催化效率最低。以R.boritolerans FW815静息细胞对2-氧代-1-吡咯烷基丁腈进行了转化条件优化,并对该菌种的腈水合酶的热稳定性进行了研究。结果表明:2-氧代-1-吡啶烷丁基转化成相应的酰胺的最适缓冲体系为20.0 mmol/L pH8.0 Na2HPO4-NaH2PO4,最适温度为35℃,腈水合酶的热稳定性较差,在35℃下保温40 min后,只保留了 56.9%左右的酶活,2 h后基本丧失酶活,表观活化能Ea为139.4 KJ/mol。对菌种中的腈水合酶的动力学参数进行了研究,在低底物浓度的情况下,测得腈水合酶的Km为240.8 mmol/L,Vmax为0.176 mmol · L-1 · min-1。研究了R.boritolerans FW815两相水合工艺,通过正己烷和水构建两相体系催化2,2-二甲基环丙甲腈生成2,2-二甲基环丙甲酰胺。通过工艺条件优化,得到最佳的两相反应体系,有机溶剂/水为3:7、温度40℃、pH为7.0、离子强度为10 mmol/L。与全水相相比,两相反应体系在一定程度上解除了底物抑制作用。