线粒体偶联因子6在糖尿病中的临床意义及其机制研究研究背景糖尿病患者心血管疾病的发病率和死亡率显著增加，多种心血管疾病的危险因素在糖尿病患者中集簇，以致疾病早期就存在严重的内皮细胞损伤，导致内皮细胞旁／自分泌功能发生病理性改变，各种异常分泌的生物活性物质相互作用，进一步加剧内皮功能不全。内皮依赖性舒张血管功能受损是内皮功能不全的核心环节，在糖尿病及其血管并发症中尤为突出。在内皮源性舒张血管物质中，前列环素（PGI₂）广泛存在于各组织器官中，具有潜在的重要心血管调控作用。糖尿病患者血浆PGI₂水平异常，可能是心血管疾病发生的重要因素之一。既往研究发现糖尿病及高血糖刺激可改变环氧化酶活性，致使PGI₂合成与释放减少，而应用PGI₂类似物防治糖尿病心血管并发症具有明确的疗效。但过去对糖尿病中PGI₂异常及其调控机制的认识不够深入，人们推测并一直在寻找机体内源性PGI₂抑制物质，期望以此为突破口深入揭示糖尿病及其心血管并发症的发病机制，以寻找新的治疗靶点。偶联因子6（CF6）是新近发现的、唯一的PGI₂内源性阻滞剂。早期仅认为CF6是线粒体ATP合酶柄部的一个结构亚基，与能量转导有关。最近发现CF6也大量存在于内皮细胞的表面，在剪切力或肿瘤坏死因子等因素刺激下，释放进入血液循环。动物实验证实CF6通过阻滞磷脂酶A₂（PLA₂）等途径，抑制PGI₂合成；临床研究发现CF6在高血压病、急性心肌梗死等心血管疾病中显著升高，与vW因子等内皮损伤标志物水平显著相关。CF6以循环激素样方式产生收缩血管、升高血压及提高心率等作用。上述研究发现说明循环CF6水平增加与内皮细胞损伤有关，并可能与内皮源性PGI₂降低有潜在联系。糖尿病患者存在严重的内皮损伤及功能不全，是其心血管并发症发生的基础，其中CF6循环水平的变化，对PGI₂的影响及其与糖尿病相关临床危险因素的关系目前尚不清楚；同时CF6的分泌调节机制有待阐明。研究目的1．本工作拟在2型糖尿病（T2DM）患者中测定其血浆CF6和PGI₂水平，分析二者与糖尿病临床表现的关系，以探讨CF6在糖尿病中的病理生理意义。2．在离体培养的原代人脐静脉内皮细胞（HUMECs）中，进一步研究糖尿病相关危险因素对CF6的影响。观察高糖对CF6合成、分泌的作用以及高糖状态下蛋白激酶C（PKC）及促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路分子的活化及其对CF6分泌的可能影响，以期探讨影响临床糖尿病患者循环CF6水平的可能机制。对象与方法根据WHO制定的糖尿病诊断标准，自2005年4月至11月期间，收集连续入院就诊的T2DM患者，依照拟定的纳入标准和排除标准，共有70例患者符合要求，允许纳入本研究最终分析阶段。其中，男37例，女33例，平均年龄（59.7±11.4）岁，糖尿病病程（9.3±3.4）年。对照组共收集56例，男性30例，女性26例，平均年龄（56.2±12.0）岁，年龄、性别构成在两组间基本一致。所有受试者均签署知情同意书并得到伦理委员会批准。患者入院次日清晨空腹抽静脉血测定CF6、PGI₂、血糖以及其他生化指标。每位患者仔细记录年龄、性别、吸烟情况、冠心病家族史、用药史、既往病史，并完善检查身高、体重、血压腰围、臀围等项目以及心电图、胸片、眼底检查等辅助检查。基于血糖升高是糖尿病最重要的危险因素之一，临床研究发现T2DM患者血浆CF6水平升高并与空腹血糖水平显著正相关（r=0.535，P＜0.01），为进一步探讨二者关系，我们在体外原代培养的HUMECs上，观察高糖刺激对CF6分泌的影响。在所有的实验中，以5×10⁵密度种植细胞，生长至亚融合状态用于实验。干预处理前，先剥夺富含血清（10％FBS）的生长培养基，将HUVECs以2％FBS在37℃培养24h。待生长至融合态后，分别给5.6mmol／L（对照组）、10mmol／L、20mmol／L、30mmol／L（高糖组）D-葡萄糖孵育，并以5.6mmol／L葡萄糖加24.4mmol／L甘露醇作为渗透压影响的对照组。在细胞内信号转导途径研究中高糖孵育前2h给予各种阻滞剂，对照组除外。采集标本后，成批测量样本加入抑肽酶，低温冰箱保存。用放射免疫（RIA）液相均相竞争反应法测定CF6和PGI₂，按试剂说明书配制各种试剂和操作；用葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖；其他指标采用常规实验室方法测定。用实时定量RT-PCR方法检测CF6 mRNA的表达，并用Western blot方法检测MAPKs通路蛋白水平。临床和基础实验分组收集数据资料，整理分析。应用SPSS 11.5软件，计算组间统计学差异，并进行单变量及多变量相关和回归分析。P＜0.05认为有统计学意义。研究结果1．研究对象临床特征：T2DM患者在年龄、性别、吸烟、体重指数方面和对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）；但患者空腹血糖、甘油三酯和低密度脂蛋白水平明显高于对照组(均P＜0.05。糖尿病患者收缩压（P=0.086）与舒张压（P=0.116）水平较对照组差异无统计学意义。2．T2DM患者血浆CF6水平（262.1±49.9）pg／ml比对照组高23.9％（P＜0.01），患者血浆6-keto-PGF1a水平（13.7±3.9）pg／ml比对照组降低16.5％（P＜0.05）。患者血浆6-keto-PGF1a水平与CF6水平呈显著负相关关系（r=-0.52，P＜0.01）。3．分析临床危险因素发现，吸烟患者血浆CF6水平显著高于不吸烟患者（293.1±56.2pg／ml对255.6±46.4 pg／ml，P＜0.05）。但本组患者血浆CF6水平在有无高血压病分组间的差异无统计学意义。血浆CF6水平在不同性别间差别无统计学意义（男259.7±46.6pg／ml对女264.6±53.9pg／ml，P=0.687）。应用胰岛素治疗患者的血浆CF6水平显著低于非胰岛素治疗者（249.13±65.9pg／ml对281.75±55.4pg／ml，P＜0.05）。4．单变量简单相关分析显示，患者血浆CF6水平与空腹血糖（r=0.535，P＜0.01）、GHbA_1c、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白及载脂蛋白B水平均显著相关；以CF6水平为因变量，选择年龄、性别、血糖、血脂及血压等指标为自变量进行多元回归分析显示：两步选入的变量分别为GHBA_1c和LDL，无变量从方程中剔除。回归分析第一步接受变量为GHBA_1c（r=0.553，R²=0.306，P＜0.01），第二步接受GHBA_1c和LDL（r=0.638，R²=0.406，P＜0.01）；对方程检验有统计学意义（F=21.575，P＜0.01）；回归方程为CF6=105.95+12.24×GHBA_1c+16.44×LDL。即，GHBA_1c和LDL是影响T2DM患者血浆CF6水平的独立因子。血浆6-keto-PGF1a水平与空腹血糖、GHbA_1c及CF6水平均显著相关。以血浆6-keto-PGF1a水平为因变量，多元逐步回归分析显示血浆CF6水平是影响T2DM患者6-keto-PGF1a水平变化的独立因子（r=-0.521，R²=0.27，P＜0.01）。5．离体实验发现，排除渗透压影响后，高浓度葡萄糖孵育内皮细胞，CF6基因表达和蛋白释放水平均呈时间和浓度依赖性增加。分别给予10mmol／L，20mmol／L和30mmol／L浓度葡萄糖孵育24h后，培养基中CF6浓度比对照组（123.8±14.7pg／ml）分别增高28.5％（P＜0.05），116.2％（P＜0.01）和125.5％（P＜0.01）。以含30mmol／L葡萄糖培养基孵育细胞后，时间依赖性增加CF6分泌水平（6h 163.5±20.4 pg／ml；12h 201.0±35.0pg／ml；24h 272.3±33.0 pg／ml和48h 266.5±13.2 pg／ml），24h达到稳态水平，较对照组培养基中CF6浓度高2.2倍（P＜0.01）。CF6基因的表达有相似改变。6．用30mmol／L葡萄糖孵育HUVECs显著促进p38 MAPK的磷酸化水平，而甘露醇对照组未发现该作用。并且，PKC抑制剂和p38 MAPK抑制剂能够抑制高糖诱导的p38 MAPK磷酸化。同时发现，高糖诱导的CF6分泌能够被PKC阻滞剂和P38 MAPK阻滞剂显著抑制，其抑制率分别为-45％（P＜0.01）和-23％（P＜0.018）；同样，上述阻滞剂也抑制高糖诱导的CF6mRNA表达（均P＜0.01）。7．胰岛素抑制高糖刺激的CF6分泌，胰岛素(10^-7mol／L)与高糖共孵育HUVECs 24h后，培养基中CF6浓度较单纯高糖孵育组降低56.6％（P＜0.01）。同样，与单纯高糖组比较，加入胰岛素共孵育内皮细胞能够显著抑制高糖诱导的CF6mRNA表达增加（P＜0.01）。结论及意义1．T2DM患者血浆CF6水平升高，并与其PGI₂水平降低独立相关。提示T2DM患者CF6升高可能通过抑制PGI₂等途径参与糖尿病及其心血管并发症的发生，为体液因素参与糖尿病发病提供了新认识。2．T2DM患者血糖水平与循环CF6升高显著正相关；体外高糖刺激HUVECs也能促进CF6表达与分泌。表明高糖可能是新发现的促进内源性CF6分泌的刺激因子。3．PKC及P38MAPK等细胞内信号通路分子活化参与高糖诱导的内皮细胞CF6释放。提示探讨糖尿病CF6异常与PKC、MAPKs、PGI₂等相关因子的关系，可能具有重要理论和临床价值。4．体内外实验均提示胰岛素抑制高糖诱导的CF6分泌，提示胰岛素治疗可能有助于降低糖尿病患者循环CF6水平异常。