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利用来源于病毒本身的基因或核苷酸序列转化植物来获得抗病毒的工程植株，已成为遗传工程中改良作物对病毒病抗性的主要措施之一。利用病毒的外壳蛋白（CP）基因为转基因（transgene）是较为成熟的抗病毒育种策略。但是，一些转病毒CP基因的转基因植物的抗病机制（是RNA介导还是蛋白质介导）目前还有争议。近年来，RNA介导的抗性已成为植物抗病毒基因工程领域研究的热点。本研究以马铃薯Y病毒（PVYN）为基因源，分别克隆了翻译的PVYN CP基因和非翻译的PVYN CP基因，构建了两种植物表达载体，并转化了烟草NC89。对这两种转基因植物进行了抗病性、分子生物学及生物学鉴定和比较。同时，对从山东省内分离的两个PVY病毒分离物进行了初步研究，具体结果如下： 1．根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系（PVYN）核苷酸序列，设计并合成了两种寡聚核苷酸引物，以PVYN的RNA为模板，扩增出翻译的PVYN CP（简称CPN）基因和非翻译的PVYN CP（简称CPM）基因，将扩增的片段克隆到载体pBSK的BamHI和KpnI之间，并进行了序列测定。分别用BamHI和KpnI从重组克隆载体上将CPM和CPN基因切下，并插入植物表达载体pROKⅡ 35S启动子下游，利用PCR筛选及酶切鉴定得到含CPN的重组克隆pPVYCPN和含CPM的重组克隆pPVYCPM。用三亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌，分别获得了含pPVYCPN和pPVYCPM质粒的农杆菌菌株，用于普通烟草的转化。 2．将含外源基因的根癌农杆菌与烟草栽培品种NC89叶盘共培养，将再生苗在含卡那霉素的培养基上选择，分别获得经CPN和CPM基因转化的植株277株和245株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行分子生物学检测表明，在含有150mg/L卡那霉素的培养基上转CPN和CPM基因的植株分别有95％和98％为Dot-blot阳性植株，即获得了263株含CPN的T0代转基因烟草和240株含CPM的T0代转基因烟草。 3．T0代转基因植株的抗病性分析表明，以PVYN的病汁液为接种物时，两种类型的转基因烟草对PVYN的抗病性具有相似性。但同一类型的不同转基因植株对PVYN的抗性强度不同。我们将其表现型分为三种类型：高度抗病（植株整个生育期未检测到病毒）、抗病（植株前期未检测到病毒，但在接种20-30天后植株表现轻微症状）和感病（转基因植株与非转基因对照植株的症状相似）。而且高度抗病型的植株占转基因总株 浙 江 大 学 博 士 学 位 论 文数的 8％左右。分别用提纯 PVYN病毒粒体和 PVYN RNA为接种物的实验表明，T。代转基因植株表现的抗病性不受接种物性质及其剂量的影响。表现型为高度抗病的含CPM的 T。代转基因植株对马铃薯 Y病毒普通株系JVY勺的侵染也表现为高度抗病。 4．用单一限制性内切酶酶切TO代转基因植株的总＊NA，并进行Scut昨rn印迹杂交实验，结果表明，目的基因已经整合到烟草染色体上。对部分不同抗性的几代转基因植株所含转基因拷贝数的分析初步证明，这两种转基因植株的抗病性与转基因拷贝数都成正相关。绝大多数高度抗病植株含56个转基因拷贝，抗病植株含34个转基因拷贝，而感病植株一般含1－2个转基因拷贝。 5．T。代转基因植株的Northern印迹杂交证明，这两种类型的CP基因都在RNA水平上得到了表达，并且目的基因的RNA在细胞内的积累量与转基因植株的抗病强度成反相关，即高度抗病型植株内目的基因NA在细胞内积累量较少，感病型植株内目的基因RNA积累量较多，而抗病型的则介于二者之间。 6．TO代转基因植株帅悦em印迹杂交表明，在表达非翻译的P＊／＊P基因的转基因植株内未检测至CP蛋白，而导入翻译的PVYNCP基因的植株内检测至了CP蛋白，但是，PVYN CP蛋白含量与抗病性不存在相关关系。 7．以选择标记卡那霉素基因对卡那霉素的抗性为标记，对部分不同抗性的转基因植株卜代进行分离鉴定，并以PCR进一步证实，结果表明，转基因植株的遗传是复杂的。在所测试的 50株范围内，高度抗病植株的遗传不符合孟德尔的 3：1和 15：1的分离规律；抗病植株的遗传有的符合15：1的分离规律，但多数不符合。分子分析表明，外源基因在转基因植株乃代中能够遗传，并且在NA水平上正常表达。 8．从山东省种植的烟草和马铃薯上获得了PVY病毒的两个分离物，分别为PVY－T和 PVYP，实验初步表明 PVY－T属于 PVY“株系，PVYF属于 PVY”株系。两者在生物学特性及其侵染寄主导致的细胞病变差异，可作为区别PVY不同株系的依据。