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目的:通过建立小鼠哮喘模型,检测Rac1在小鼠哮喘模型前后相关组织中表达水平的改变情况,并分析Rac1与2型固有淋巴细胞(ILC2)相关细胞因子如IL-5、IL-33、IL-13表达的关系,观察其对气道炎症的影响,探讨Rac1调节免疫应答反应类型和参与哮喘病理损伤的可能机制,为进一步深入研究哮喘病的发病机制奠定基础,拓展哮喘病临床干预的新思路。方法:1.卵清蛋白(OVA)哮喘模型的建立:哮喘建模参照文献并稍加改进,即实验组小鼠在第1d和第11d分别腹腔注射50μg OVA和10%氢氧化铝佐剂,对照组注射相等量的生理盐水(NS),第22d开始实验组各小鼠给予雾化吸入2%的OVA与生理盐水的混合溶液,激发小鼠的I型超敏反应,1次1小时,每天雾化1次、一连5d。同时,正常组小鼠给予吸入相等的NS。2.Rac1抑制剂(EHT1864)干预试验:在建模过程中,于雾化前三天连续给小鼠腹腔注射EHT1864,其他步骤同上述哮喘模型建立。EHT1864粉剂在使用前用生理盐水溶解并充分混匀,用药量为40mgkg。3.定量-PCR检测m RNA:取小鼠支气管肺泡灌洗、外周血单个核细胞,经离心获得细胞沉淀;取左边肺组织,充分剪碎研磨得到组织悬液。于上述细胞或组织悬液加入Trizol以裂解细胞并获取总RNA,然后再进行逆转录反应合成c DNA。继而做实时荧光定量PCR,检测Rac1及ILC2相关细胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)m RNA的表达。4.酶联免疫吸附试验:取小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)或眼球外周血,经离心后得到灌洗液上清和外周血血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测ILC2相关的细胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)蛋白表达水平。5.组织切片病理观察:取小鼠右肺组织置于福尔马林中经固定、石蜡包埋等一系列过程制成切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察病理表现。6.荧光抗体染色:取小鼠支气管置于福尔马林中经固定、石蜡包埋等一系列过程制作成石蜡切片,再用直接法进行免疫荧光抗体染色,检测支气管中Rac1的表达情况。7.采用Graph Pad Prism5软件进行统计分析:对哮喘小鼠肺组织Rac1和细胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)的表达水平进行直线相关分析,组间均数比较采用两样本非配对T检验,相关性分析选用Pearson法,P<0.05,表明差异有统计学意义,多组间的统计分析采用0ne-way ANOVA,P<0.05,表明差异有统计学意义。结果:1.通过哮喘模型制作过程对小鼠的观察可见,哮喘组小鼠表现为烦躁不安,出现频繁瘙痒的行为,同时还伴有呼吸加深加快、打喷嚏、大小便失禁、擤鼻等典型的哮喘表现,而对照组无明显异常表现。2.肺组织病理观察结果:HE染色显微镜下可见,哮喘组小鼠肺泡间及周围小血管出现大量炎症细胞,如嗜酸性粒细胞浸润、气道内杯状细胞肥大增生、血清总Ig E及OVA-Ig E含量均高于对照组。而对照组小鼠可见,肺组织气道结构清晰、气管周围无细胞浸润、炎症性改变不明显。3.免疫荧光分析表明:哮喘模型小鼠Rac1的水平与正常小鼠相比显著下降,EHT1864干预后,Rac1的表达进一步下调。4.定量RT-PCR分析结果:哮喘小鼠肺组织或肺泡灌洗液Rac1 m RNA表达水平均明显低于正常对照组,使用EHT1864干预后,Rac1水平则进一步降低。5.小鼠肺组织表达ILC2相关细胞因子的检测:通过分析模型组与正常组目的基因m RNA表达水平,结果显示,哮喘小鼠肺组织的IL-5、IL-33和IL-13的水平与正常组小鼠相比均显著增高;EHT1864处理组的IL-5、IL-33和IL-13的水平上调尤为显著。此结果表明Rac1的降低与ILC2相关细胞因子水平的升高存在着紧密的联系。6.ELISA检测外周血上清IL-5、IL-33和IL-13蛋白表达水平的结果表明,哮喘模型组小鼠上述细胞因子水平均高于对照组。7.分析肺组织中Rac1与IL-5、IL-33和IL-13m RNA表达水平关系的相关性结果显示,哮喘小鼠肺组织Rac1的m RNA水平与IL-5、IL-33和IL-13的m RNA水平均显示明显的负相关。结论:在哮喘小鼠,IL-5、IL-33和IL-13的m RNA和蛋白表达水平与对照组相比都显著增高,同时Rac1的表达却显著下降。相关性分析表明Rac1和ILC2s相关细胞因子(IL-5,IL-33,IL-13)之间存在显著地负相关。为了进一步证明Rac1在哮喘发病机制中的作用,在小鼠激发之前给予EHT1864干预后,随着Rac1表达水平的进一步下调,导致ILC2s相关细胞因子水平明显增高,同时小鼠的哮喘症状及肺组织组损伤加重。这些结果可以推测Rac1可以影响哮喘的发病过程,如果将Rac1的受体激动剂用于哮喘病人,有可能会有效改善炎症状态。进一步研究Rac1在哮喘中的作用,有利于了解哮喘的免疫机制,可以帮助我们找到预防和治疗哮喘的新靶标。