目的:本研究以中医脉络学说及营卫理论为指导,采用单纯高脂饮食建立兔AS早期病变高脂血症模型,高脂饮食叠加右侧颈动脉硅胶管包裹术建立复合模型,通过观察3天、1周、2周和4周时间节点各组颈动脉病理形态、血脂、外膜滋养血管新生变化情况,探讨外膜滋养血管新生在AS早期病变中的作用;根据模型制备成功时间,选择术后4周为时间节点,围绕交感/副交感神经和氧化应激,深入探讨AS早期外膜滋养血管新生相关机制及通络药物的干预作用。方法:1外膜滋养血管新生在动脉粥样硬化早期病变中的作用180只健康新西兰兔适应性喂养2周后随机分为正常组、高脂组及复合模型组,每组60只。正常组给予普通饲料,高脂组给予高脂饮食喂养建立AS早期高脂血症模型,复合模型组给予高脂饮食叠加右侧颈动脉硅胶管包裹术,实验周期为4周。于术后3天、1周、2周和4周末行左心室灌注Microfil造影剂进行Micro-CT检查;DYE-TRAK彩色微球检测术侧颈动脉管壁微血管血流量;生化法检测血脂水平;HE染色观察颈动脉病理形态学变化;Western Blot检测颈动脉外膜新生微血管CD34蛋白表达。2交感/副交感神经和氧化应激损伤在外膜滋养血管新生中的作用及通络干预研究90只健康新西兰兔随机分为正常组、高脂组、复合模型组、复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+桂芍通络低剂量组和复合模型+阿托伐他汀组,各组15只。造模同第一部分。各治疗组实施高脂饮食复合右侧颈动脉硅胶管包裹,于造模当天同时给予药物干预,用0.5%羧甲基纤维素钠混悬液将药物配成所需浓度,给药剂量为:桂芍通络高剂量0.6g/kg/d、低剂量为0.3g/kg/d(相当于临床等效量),阿托伐他汀2.5mg/kg/d,灌胃容积为3ml/kg,其他组别同第一部分,给药4周后取材。生化法检测血脂水平、黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(sod);tba法检测丙二醛(mda);化学比色法检测总抗氧化能力(t-aoc);he染色检测术侧颈动脉形态学变化;原位杂交检测外膜p22phox、gp91phox杂交信号;micro-ct检测术侧颈动脉外膜微血管密度;彩色微球检测微血管灌注血流量变化;免疫组化检测颈动脉外膜ngf、th表达情况;westernblot检测颈动脉组织ngf、th、ache、vegf、vegfr-2、erk及p-erk蛋白表达水平。3ngf/trka/erk1/2通路在外膜滋养血管新生中的作用及通络干预研究90只健康新西兰兔随机分为正常组、高脂组、复合模型组、复合模型+pd98059(erk抑制剂)组、复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+pd98059+桂芍通络高剂量组,各组15只。提前将100ulpd98059溶解液置于25ml25%pluronic@f-127凝胶液中,制成pd98059载药凝胶(终浓度为200μmol/l)。将0.5ml缓释凝胶导管注入硅胶管,包裹于右侧颈动脉,抑制外膜局部erk信号通路。于造模当天同时给予桂芍通络灌胃,实验周期为4周。he染色观察动物术侧颈动脉形态学变化;彩色微球检测微血管血流量变化;免疫组化检测颈动脉外膜ngf表达情况;westernblot检测颈动脉外膜中ngf、trka、vegf、erk及p-erk蛋白表达。结果:1外膜滋养血管新生在动脉粥样硬化早期病变中的作用1.1各组不同时间节点血脂水平变化与正常组比较,高脂组血清tc、tg、ldl-c水平于高脂喂养2周到4周逐渐升高,复合模型组tc、tg、ldl-c水平于1周到4周逐渐升高,且差异均有统计学意义(p<0.01)。与高脂组相比,复合模型组血清tc、tg、ldl-c水平于1周时明显升高,统计学差异具有显著性(p<0.01),2周和4周时仍有升高趋势。1.2各组颈动脉形态学变化(he染色)正常组颈动脉内膜光滑呈波浪状,内皮细胞完整连续,中膜以平滑肌细胞为主;高脂组和复合模型组3天、1周内皮细胞完整,胞核扁平,中膜平滑肌走形清晰,2周内膜轻微增厚,4周内膜增生,中膜间隙增宽;而复合模型组4周内膜弥漫性增生,可见少量泡沫状巨噬细胞,血管中膜间隙增宽,平滑肌和弹力纤维排列紊乱,损伤程度较高脂组更重。1.3各组颈动脉壁微血管密度比较正常血管滋养管沿颈动脉规则的纵向排列,高脂组和复合模型组颈动脉术侧血管壁面积及微血管密度自术后1周开始持续升高,与同期正常组比较,差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01);与高脂组相比,复合模型组术侧血管壁面积及微血管密度从实验1周后出现增加趋势,2周和4周微血管密度明显增加,外膜滋养血管呈致密的微血管丛分布,有显著统计学差异(p<0.05,p<0.01)。1.4各组颈动脉术侧管壁微血管血流量比较与同期正常组相比,高脂组术侧管壁微血管血流量自术后2周开始升高(p<0.05);复合模型组在1周时已出现升高趋势,2周后呈进行性升高(p<0.01);相较于高脂组,复合模型组管壁微血管血流量在1周和2周时即出现升高趋势,4周时管壁微血管血流量明显升高(p<0.05)。1.5各组颈动脉外膜cd34蛋白表达比较正常颈动脉外膜新生微血管cd34蛋白表达量较少;高脂组cd34蛋白表达量自1周至4周呈进行性升高,差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01);而复合模型组cd34蛋白表达量从3天至4周呈进行性升高,差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01)。2交感/副交感神经和氧化应激损伤在外膜滋养血管新生中的作用及通络干预研究2.1各组血脂水平变化与正常组比较,高脂组和复合模型组血清tc、tg和ldl-c水平显著升高,差异均有统计学意义(p<0.01);与复合模型组比较,复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+桂芍通络低剂量组和复合模型+阿托伐他汀组给药后血清tc、tg和ldl-c水平明显降低,有显著统计学差异(p<0.01);各用药组之间两两比较无显著统计学差异(p>0.05)。2.2各组血清mda、sod及t-aoc含量变化与正常组比较,高脂组和复合模型组血清mda水平显著升高,血清sod及t-aoc水平下降,差异有统计学意义(p<0.01);与复合模型组比较,复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+桂芍通络低剂量组和复合模型+阿托伐他汀组给药后血清mda水平下降(p<0.01),血清sod和t-aoc水平明显升高(p<0.01),各用药组之间两两比较无显著统计学差异(p>0.05)。2.3各组动脉形态学变化2.3.1颈动脉形态学变化(he染色)正常组颈动脉内膜光滑,内皮细胞平整连续,与内弹力板贴合紧密,中膜以平滑肌细胞为主,走行清晰,外膜可见少量微血管;高脂组内膜增生,中膜间隙增宽,外膜微血管数量增多;复合模型组内膜弥漫性增生,可见少量泡沫状巨噬细胞,血管中膜间隙增宽,平滑肌和弹力纤维排列紊乱,外膜微血管数量丰富;各用药组颈动脉病理损伤不同程度减轻:内膜增生减轻,部分弹力纤维排列紊乱,中膜平滑肌走行较清晰,外膜微血管数量不同程度减少。2.3.2主动脉形态学变化(油红o染色)正常组主动脉呈乳白色,内膜光滑,未见油红着色;高脂组主动脉弹性较差,可见少量斑片状红色区域;复合模型组主动脉弹性差,胸主动脉下段、腹主动脉及分支部分可见斑片状红色,即脂质条纹;各药物干预组内膜斑片状红色分布减少,内膜较光滑。2.4nadph氧化酶亚单位gp91phox和p22phox分布与表达正常组中gp91phox和p22phox基因杂交信号表达量极少,高脂组和复合模型组gp91phox和p22phoxmrna杂交颗粒广泛分布,尤以内膜和外膜部位显著,各用药组gp91phox和p22phoxmrna杂交信号在内膜、外膜分布均有不同程度减弱。2.5各组术侧颈动脉管壁微血管血流量比较与正常组比较,高脂组和复合模型组管壁微血管血流量明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);与复合模型组比较,复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+桂芍通络低剂量组和复合模型+阿托伐他汀组颈动脉管壁微血管血流量均明显减少,有显著统计学差异(p<0.05,p<0.01),各用药组之间两两比较无显著统计学差异(p>0.05)。2.6免疫组化法检测颈动脉外膜ngf、th的分布与表达与正常组相比,高脂组和复合模型组的颈动脉中膜-外膜区域ngf、th抗体染色阳性表达增多,与复合模型组比较,复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+桂芍通络低剂量组和复合模型+阿托伐他汀组均能减少颈动脉中膜-外膜区域分布的ngf、th蛋白表达量。2.7颈动脉外膜ngf、th、ache、vegf、vegfr-2、erk、p-erk蛋白表达比较正常组、高脂组、复合模型组及各用药组总erk蛋白表达未见明显差异(p>0.05)。与正常组比较,高脂组ngf、th、ache、vegf、vegfr-2、p-erk蛋白表达上调(p<0.01);与高脂组比较,复合模型组ngf、th、ache、vegf、vegfr-2、p-erk蛋白表达显著上调,有显著统计学差异(p<0.01);与复合模型组比较,复合模型+桂芍通络高剂量组、复合模型+低剂量组和复合模型+阿托伐他汀组ngf、th、ache、vegf、vegfr-2、p-erk蛋白表达明显下调(p<0.01),各用药组间两两比较无显著统计学差异(p>0.05)。3ngf/trka/erk1/2通路在外膜滋养血管新生中的作用及通络干预研究3.1颈动脉形态学变化(he染色)正常组颈动脉内皮细胞连续平整,与内弹力板贴合紧密,平滑肌走形清晰,外膜可见少量微血管;高脂组、复合模型组及复合模型+pd98059+桂芍通络高剂量组内膜增厚,中膜间隙增宽,平滑肌和弹力纤维排列紊乱,外膜微血管数量丰富;复合模型+pd98059组和复合模型+桂芍通络高剂量组内膜增生较轻,中膜平滑肌走形较清晰,外膜微血管数量也不同程度减少。3.2各组术侧颈动脉管壁微血管血流量与正常组相比,高脂组颈动脉管壁微血管血流量增加,差异有统计学意义(p<0.01);与高脂组相较,复合模型组管壁微血管血流量明显增加(p<0.01);与复合模型组相比,复合模型+pd98059组和复合模型+桂芍通络高剂量组管壁微血管血流量显著减少,有显著统计学差异(p<0.01);与pd98059组比较,pd98059+桂芍通络高剂量组微血管血流量明显增加(p<0.01)。3.3颈动脉外膜ngf、trka、vegf、erk及p-erk蛋白表达正常组、高脂组、复合模型组及各用药组总erk蛋白表达未见明显差异(p>0.05)。与正常组相比,高脂组ngf、trka、vegf、p-erk蛋白表达上调(p<0.01);与高脂组相比,复合模型组ngf、trka、vegf、p-erk蛋白表达显著上调(p<0.05,p<0.01);与复合模型组比较,复合模型+pd98059组和复合模型+桂芍通络高剂量组颈动脉外膜组织中ngf、trka、vegf、p-erk蛋白表达明显下调(p<0.01),与复合模型+pd98059组比较,复合模型+pd98059+桂芍通络高剂量组对ngf、trka、vegf、p-erk蛋白表达的干预作用有显著统计学差异(p<0.01)。结论:1本研究以营卫理论与脉络学说为指导,探讨动脉管壁vv新生在as早期病变中的作用。基于营行脉中与血管内皮相关,卫行脉外与血管外膜相关,“孙络”与“微血管”在解剖形态学上的同一性,以高脂饮食损伤内皮建立高脂血症兔模型,高脂饮食叠加右侧颈动脉硅胶管包裹术损伤外膜建立复合模型,探讨动脉管壁vv新生在as早期病变中的作用及营卫通络方药干预作用,不仅有助于揭示营卫“由络以通,交会生化”异常的病理生理学基础,对于阐明as“由外向内”的发病机制,寻找有效的干预药物具有重要意义。2以高脂饮食建立高脂血症兔模型,高脂饮食叠加右侧颈动脉硅胶管包裹术建立复合模型,与正常组比较,高脂组1周时微血管新生cd34蛋白表达量上调,微血管密度增加,2周时微血管灌注血流量升高;而复合模型组3天时cd34蛋白表达量较正常组上调,3天及1周时cd34蛋白表达量明显高于高脂组,1周时微血管密度较高脂组出现升高趋势,2周和4周时升高有统计学差异,微血管灌注血流量1周时出现较高脂组升高趋势,4周较高脂组明显升高;颈动脉形态学示高脂组及复合模型组2周时内膜轻微增厚,4周时明显增生,而复合模型组4周时内膜增生程度较高脂组严重,以上结果表明高脂可引起外膜vv新生,且先于内膜增生发生;复合模型可引起外膜vv新生程度加重,最终影响并加重as病变程度。3与正常组比较,高脂组和复合模型组血管内膜和外膜均可见明显的gp91phox和p22phoxmrna杂交颗粒分布,血清mda水平显著升高,血清sod及t-aoc水平下降;高脂组ngf,trka,th,ache,vegf,vegfr-2,p-erk1/2蛋白表达量上调,ne表达量增加,微血管密度及灌注血流量增加,而复合模型组除NE及微血管密度外,其余上述指标均较高脂组升高,表明高脂组和复合模型组在引起外膜VV新生的同时伴有氧化应激损伤及交感神经过度激活,复合模型组交感神经激活程度较高脂组严重;NGF/TrkA/ERK1/2通路参与交感神经过度激活促进外膜VV新生的病理过程。4以营卫理论与脉络学说指导研制的营卫通络方—桂芍通络能够抑制AS早期外膜VV新生,减少外膜VV密度及血液灌注量,其具体机制可能与抑制NGF/TrkA/ERK1/2通路,抑制交感神经过度激活,改善交感/副交感神经表达失衡,降低颈动脉外膜局部及血清氧化应激损伤有关。