禽流感(Avian Influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。它是造成全球突发卫生事件最常见的传染病,自1878年意大利鸡群首次爆发该病以来,世界各地都相继有各种亚型的禽流感病毒(AIV)引起的AI暴发。尤其是高致病力禽流感可导致高达100%发病率和/或死亡率。并可直接感染人并致人死亡。而低致病力禽流感病毒同样可以给养禽业带来灭顶之灾,对人类的威胁同样严重,尤其是H9亚型禽流感。特别是1997香港禽流感事件以及2003年末至2004年初禽流感在东南亚各国和中国的大面积暴发,引起了人们的高度重视。 A型流感病毒亚型众多,易变。目前,已经发现了15种H亚型和9种N亚型,且各亚型之间无血清学交叉反应。从而导致该病的诊断和治疗非常困难。因此,迫切需要一种较为理想的禽流感亚型诊断方法。血凝素(HA)糖蛋白为病毒最重要的表面抗原,具有亚型特异性,同时可以诱导特异性抗体的产生。因此,利用HA蛋白有望建立一种诊断禽流感亚型的方法。鉴于此,本研究利用禽流感H5、H9亚型HA蛋白作为诊断抗原建立了诊断禽流感亚型的ELISA检测方法。该方法快速、灵敏、准确、简便,可以直接检测到亚型,该方法的建立对进出口检验检疫,禽流感的防制具有十分重要的意义。主要研究内容包括: 1.H5N1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与序列分析 本研究根据GenBank收录的H5N1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,利用RT-PCR方法从本室分离鉴定并保存A/Chicken/HuBei/326/2002(H5N1)、A/Duck/HuBei/405/2003(H9N2)禽流感病毒中扩增了血凝素基因,将两种扩增产物分别克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定用以筛选阳性克隆子。结果发现H5N1HA、H9N2HA分别为1707bp和1683bp。 2.H5N1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的亚克隆及原核表达 基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST蛋白融合表达。SDS-PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量分别约为90KDa、92KDa。Western blot印迹表明表达蛋白具有免疫学活性,位于包涵体中。