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腺病毒载体是目前发展较快的载体系统，已被广泛应用在在基础和临床研究中。腺病毒载体与其它载体相比确有许多优越之处.表现在以下几个方面：(1)对腺病毒的基因组结构和功能已有较深人的研究，为基因载体的研制打下了坚实的基础。(2)腺病毒本身DNA长度为36kb，其中除微型腺病毒载体(mini-AdVector)基本结构外，其余部分基因组都可被置换，其承载容量大。(3)对多数组织、细胞均有感染性，包括非分裂期细胞，宿主范围广。(4)载体制备较简单，易操作。(5)载体比较稳定。(6)由于腺病毒的复制，繁殖独立于宿主细胞染色体外，其基因组不会整合人宿主细胞的基因组.因此，其遗传毒性低。(7)腺病毒作为活疫苗已经应用，没有明显的负作用。
由细胞周期蛋白(cyclin)，细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindependentkinase,CDK)，细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclindependentkinaseinhibitor,CKI)组成的细胞周期调节网络，与肿瘤发生的关系越来越引起人们的关注。p21WAF1(wild-typep53activatedfragment-1,WAF1)是CDKI家族中最早被发现的成员，是细胞周期调控的主要分子之一。
本实验采用AdEasy系统成功构建了p21基因重组腺病毒。首先将p21基因克隆到腺病毒转移质粒，得到的重组腺病毒转移质粒与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌内发生同源重组，构建了重组腺病毒质粒，将其转染293细胞进行包装，得到重组腺病毒。在此基础上，对重组腺病毒纯化方法、纯化病毒的质量分析、纯化病毒对人白血病细胞系K562细胞体外生长影响进行了初步研究。
1.构建重组腺病毒转移质粒采用PCR从携带p21基因质粒中扩增p21基因，在5’端和3’端PCR引物中分别引入BglⅡ和HindⅢ酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到经同样双酶切的腺病毒转移质粒pShuttle-CMV的多克隆位点中，转化大肠杆菌DH5α，重组质粒经PCR鉴定、酶切图谱分析、序列测定分析，结果表明成功构建了携带p21基因的重组腺病毒转移质粒。
2.构建重组腺病毒质粒采用改进的两步CaCl2化学转化法在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组。首先将腺病毒骨架质粒pAdEasy转化大肠杆菌BJ5183，并制备感受态菌；再将PmeI线性化的重组腺病毒转移质粒转化到已转化pAdEasy的大肠杆菌BJ5183，在大肠杆菌BJ5183提供的同源重组酶的作用下，两种质粒的同源序列发生重组。经PCR、酶切图谱分析得到了重组腺病毒质粒。
3.在293细胞内包装重组腺病毒用限制性内切酶PacI酶切重组腺病毒质粒，采用脂质体lipofectamine转染到经腺病毒E1区转化的人胚肾293细胞，包装成腺病毒颗粒。倒置显微镜下可以观察到细胞病变，透射电镜可以观察到大小约70nm的病毒颗粒，RT-PCR可以检测出目的基因的转录，West-blot检测到目的基因p21表达产物可以被p21蛋白抗体特异性识别。结果表明成功包装出p21基因重组腺病毒rAdp21.
4.层析法纯化重组腺病毒及其初步质量分析培养293细胞，感染重组腺病毒，离心收集病变的细胞冻融后收细胞裂解上清。分别采用CsCl密度梯度离心和一步离子交换层析提取病毒。对纯化的病毒进行了初步质量分析：通过紫外分光光度计A260nm/A280nm吸收值比值判断提取病毒的纯度，根据A260nm吸收值计算病毒颗粒数；采用改良的快速重组腺病毒感染滴度检测方法检测病毒滴度TCID50，结果表明两种纯化方法得到相似的结果。相比于CsCl密度梯度法，层析法体现出诸多优点：(1)，无需考虑终产品中残余CsCl的含量；(2)，不需昂贵的离心设备，相对经济；(3)，操作时间大大缩短；(4)，离子交换层析条件温和，易于线性放大。适于大规模制备工艺。另外，复制型腺病毒(RCA)检测是重组腺病毒制品安全性检查的核心指标。在重组腺病毒生产过程中的多个阶段，通过与宿主序列重组或其他途径都可能产生RCA。SFDA和FDA现推荐采用A549细胞生物学检测法进行检查。p21重组腺病毒为非复制型腺病毒，感染A549细胞后不发生CPE，但RCA感染会导致细胞发生CPE。采用rAdp21感染A549培养14天后未观察到细胞病变，与阴性对照结果一致，而野生型Ad5感染后7-10天则出现明显的细胞病交现象。以上初步质量分析结果表明纯化的病毒几项核心指标接近临床用的制品质量。
5.感染重组腺病毒对人白血病细胞系K562体外生长影响取重组腺病毒感染K562细胞，台盼蓝染料排斥实验、MTT实验、软琼脂集落形成实验均显示rAdp21能有效抑制K562细胞增殖。应用流式细胞仪分析细胞周期，感染rAdp21的细胞G0/G1期所占比例增加，表明生长抑制作用是通过细胞周期阻滞而实现；FACS检测细胞凋亡实验未观察到rAdp21明显的促凋亡现象。
上述初步研究结果表明，借助重组腺病毒感染导入p21基因的k562细胞的生长受到一定程度的抑制，表明p21基因可有效抑制K562白血病细胞的增殖。提示p21有可能作为白血病基因治疗的候选基因。其应用价值尚待进一步的细胞和动物试验进行评估。