长裙竹荪抑菌活性物质的分离纯化与鉴定

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长裙竹荪是珍贵的食药两用真菌,具有很强的抑菌作用,在天然防腐剂开发方面具有广阔的前景。本文以7种细菌、2种酵母菌和3种霉菌为供试菌,以长裙竹荪为原料,采用不同浓度的乙醇进行浸提,对其提取物的抑菌效果进行了对比;利用平板打孔法研究其对7种细菌的抑菌效果和最低抑制浓度(MIC)。其次,以提取量和抑菌效果为指标设计单因素试验,在单因素试验的基础上,设计二次通用旋转组合试验,依据回归分析确定提取工艺的最优参数。最后,通过硅胶柱层析、薄层层析和追踪性抑菌试验对粗提物进行分离纯化,用核磁共振进行鉴定,首次获得具有抗菌活性的单体化合物,为竹荪中天然抗菌物质的开发提供依据。取得的主要研究结果如下:1.长裙竹荪原料经预处理后,在不同浓度的乙醇下进行浸提,通过比较其抑菌效果,选取浓度为100%(v/v)的乙醇为提取剂。2.用平板打孔法测定粗提物对细菌、霉菌和酵母的抑菌效果,结果表明提取物对霉菌和酵母没有抑菌作用,对细菌抑菌作用显著。3.用平板打孔法、双倍稀释法、浓度梯度稀释法测定粗提物对7种细菌的最低抑菌浓度,结果表明粗提物对肠炎沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度最低,均为30mg/mL,说明长裙竹荪子实体中存在抑菌物质。4.通过单因素试验得到的合适提取条件为:提取时间2h,提取温度70℃,最适液固比25:1。同时进行了单因素的同步抑菌试验并建立了抑菌效果与提取量的相关性曲线,结果表明抑菌效果与提取量成正相关,因此在二次通用旋转组合试验中用提取量为指标代替抑菌效果来衡量抑菌物的提取效果。5.在单因素的基础上,采用三元二次通用旋转组合设计试验,得到了提取量同提取温度、提取时间、液固比的回归方程。通过对提取量回归方程的优化,确定提取量最高的提取工艺参数为:提取时间1.5h、提取温度72℃、液固比25:1。建立的回归模型达到极显著水平,可以用来分析和预测长裙竹荪抑菌物质的提取工艺。6.以抑菌直径为指标,通过萃取、3次不同流动相的硅胶柱层析、反相柱层析以及同步薄层层析,分离纯化后得到一个单体化合物。根据该化合物的核磁共振波谱数据确定该化合物为间苯三酚。7.平板打孔法、原位抑菌法、液体培养显微镜观察和半抑制浓度测定的结果表明该化合物对供试细菌有很强的抑制作用,其对肠炎沙门氏菌的半抑制浓度为51.58ng/mL,对巨大芽孢杆菌的半抑制浓度为83.06ng/mL。
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