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目的:肺炎是一种由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物等多种因素诱导的肺部急性炎症,其中,细菌性肺炎最常见。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)属于一种革兰阴性病原体,被公认为重症监护室患者肺炎的主要病原菌。作为一种机会性致病菌,它能够通过刺激呼吸道上皮细胞导致肺部炎症迁延和肺部结构受损,引发呼吸道持久性病理损伤,使得PA感染的患者常伴随严重的呼吸道症状以及肺功能障碍。PA性肺炎的发病率呈上升状态,在临床中可能存在过度治疗或治疗不佳的问题,主要原因是:(1)由于PA可能在人体潮湿部位如会阴部、腋窝、耳朵等处发生定植,且PA可无需通过上呼吸道的寄殖或吸入,直接经由鼻胃管、机械通气进入下呼吸道;(2)PA具有染色体介导的天然耐药性,从而实现对多种抗生素的耐药,且其胞浆内的耐药质粒可在其作为供体和受体菌时,实现在种间或种内的传递,在抗生素治疗中也易变异而形成多重耐药。因此,对PA引起肺损伤的机制研究是十分必要的。PA来源的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),激活各种免疫细胞,包括自然杀伤细胞、巨噬细胞和淋巴细胞,刺激宿主细胞分泌多种细胞因子,如集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白介素等,从而调控机体的免疫功能。目前,由LPS诱导的急性肺损伤动物模型已被证实并广泛应用于机制研究。但针对PA-LPS诱导的肺损伤仍缺乏有效的治疗药物及方法。氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)是一种从中药苦参的根中提取的生物碱,具有多种重要的生物学功能,可有效减缓纤维化及炎症的发生,并抑制癌细胞的增殖。近年来,许多研究也关注了OMT在肺部疾病中的疗效。研究发现,OMT在过敏性哮喘小鼠模型中发挥平喘作用,对百草枯导致的肺损伤发挥保护作用。然而OMT对PA-LPS引起的肺损伤的影响及机制仍不完全明确。有研究指出,水通道蛋白(AQP)、Na~+-K~+-ATP酶、上皮钠离子通道(epithelial Na channel,ENaC)可调控肺泡内液体的转运及肺水的清除。其中,肺泡上皮细胞中ENaC对有效清除肺水肿是必不可少的。研究发现PA及其LPS能够导致肺泡上皮细胞中ENaC的表达水平及活性下降。同时,ENaC的表达在LPS诱导的急性肺损伤动物模型中明显下调。因此,我们推测PA-LPS可能通过对ENaC的调控影响肺组织的钠/流平衡以及炎症反应。既往报道指出,OMT对心肌组织、小胶质细胞等中MAPK通路的活化具有抑制作用,而MAPK的抑制剂则对LPS诱导的肺泡细胞中ENaC的下调具有阻断作用。MAPK是哺乳动物内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,在调控许多细胞增殖、炎症相关信号通路中具有关键作用。由此我们推测,OMT可能通过MAPK通路调控上皮钠离子通道活性,进而影响PA-LPS诱发的肺损伤。为了验证以上假说,我们建立PA-LPS诱导肺泡上皮细胞的损伤模型及PA-LPS诱导小鼠肺损伤模型,同时用OMT进行预处理,检测不同处理下小鼠肺组织水肿程度、肺组织形态、肺泡灌洗液中炎症细胞含量及肺组织内炎症因子的表达;另外,我们对肺炎小鼠进行ENaC抑制剂的干预,检测了ENaC与MAPK通路的相关蛋白表达,探讨OMT对PA-LPS诱导肺损伤的作用机制。研究方法:本研究利用PA-LPS处理小鼠,建立肺炎小鼠模型,同时用不同剂量(12.5、25、50 mg/kg)OTM处理肺炎模型小鼠。LPS处理6 h后,随机选取每组3只小鼠,利用湿/干重法检测各组小鼠肺组织水肿程度差异。同时收集各组小鼠的肺组织,通过HE染色观察肺组织形态及炎症损伤;Wright-Giemsa染色观察各组小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞含量;ELISA检测肺组织内TNF-α,C-反应蛋白含量(C-reactive protein,CRP)、白介素1β(interleukin 1β,IL1β)和IL6((interleukin 6,IL6)。此外,本研究分离了原代SD大鼠肺泡上皮细胞,并用细胞免疫荧光鉴定原代大鼠肺泡上皮细胞。原代大鼠肺泡上皮细胞分别由LPS和不同剂量(250、500、1000μg/ml)OTM处理,分别培养6 h,12 h,24 h后通过MTT法检测各组细胞增殖活性。处理24 h后,收集各组细胞,Real-time PCR检测钠离子通道相关基因的表达;Western blotting检测钠离子通道及MAPK相关蛋白的表达。数据分析由SPSS统计软件(v.17.0)完成。各组数据以均数±标准差(mean±SD)表示,采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当有统计学意义时,用SNK法进行组间比较,p<0.05具有统计学意义。结果:1、成功建立PA-LPS肺炎小鼠模型。与正常小鼠相比,LPS组小鼠的肺组织湿/干重比例显著升高,炎性细胞浸润增加,肺泡灌洗液中炎症细胞含量和肺组织内CRP、TNF-α、IL1β和IL6表达升高;而经不同浓度OMT处理的小鼠则显示出较低的肺组织湿/干重比例,炎性细胞浸润减少,肺泡灌洗液中炎症细胞含量和肺组织内CRP、TNF-α、IL1β和IL6表达降低。2、成功分离SD大鼠原代大鼠II型肺泡上皮细胞。与对照组相比,LPS的处理抑制了细胞的增殖;体内外结果均显示,与对照组相比,LPS的处理可抑制αENaC,βENaC,γENaC,AQP-1、AQP-5的mRNA和蛋白表达水平,OMT的处理则可增加这些蛋白的表达,而钠离子通道的阻断剂Benzamil又抑制了这些蛋白的表达。3、体内外结果均显示,与对照组相比,LPS处理可显著促进p-ERK,p-JNK,p-p38 MAPK的蛋白表达水平,而OMT的处理则抑制了p-ERK,p-JNK,p-p38 MAPK的蛋白表达水平。结论:1、PA来源的LPS可诱导肺部水肿及中性粒细胞浸润,并可增加小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞含量及CRP、TNF-α、IL1β和IL6的表达。2、OMT抑制PA-LPS诱导的小鼠肺炎具有浓度依赖性。3、OMT可促进ENaC和AQP的上调,从而减缓LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤及PA-LPS诱导的小鼠肺炎。4、钠离子通道的阻断剂Benzamil可中和OMT的抗肺炎作用,提示OMT的抗肺炎作用是依赖于ENaC。