原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)以往又称“特发性血小板减少性紫癜”,该疾病发生是由患者对自身血小板抗原的免疫失耐受,导致血小板减少引起的。ITP患者骨髓出现巨核细胞成熟障碍,伴或不伴有皮肤、黏膜、内脏出血的临床症状,严重者甚至威胁到生命。目前西医治疗方法局限,且副作用较大。因此急需加快中药治疗ITP的研究进程。中药益气摄血方由人参、茯苓、白术、甘草、当归、川芎、白芍、阿胶、熟地黄等九味药材组成,是八珍汤的改良方剂,具有补脾益气、养血活血的功效,主要用于治疗气不摄血型原发免疫性血小板减少症。八珍汤具有气血双补的功效,能够通过抑制血小板凝集、增强机体造血功能等手段使血小板增加,还可以从调节免疫功能入手治疗ITP。但是目前还未有对中药益气摄血方治疗ITP作用机制和物质基础的研究。为了探讨益气摄血方治疗ITP的物质基础和作用机制,本研究首先用超高效液相色谱仪建立益气摄血方的特征图谱,然后利用UPLC-MS/MS技术研究益气摄血方的入血和入脾成分,最后通过网络药理学方法探讨其治疗ITP的作用机制。研究结果有助于揭示益气摄血方治疗ITP的作用机制,并为中药方剂物质基础和作用机制研究提供新的途径。目的:通过系统药理学方法研究益气摄血方治疗ITP的作用机制。采用超高效液相的检测方法建立益气摄血方的特征图谱,为明确益气摄血方的质量标准提供了方法。接下来通过液质连用的研究方法明确益气摄血方的入血成分,明确其物质基础并为下一步网络药理学预测提供数据支持。基于网络药理学的预测功能查找益气摄血方治疗ITP作用靶点,通过网络预测和大数据分析探讨益气摄血方入血成分治疗ITP的作用机制。方法:1.益气摄血方化学成分研究:将益气摄血方溶于甲醇并超声处理制备供试品溶液,以0.1%磷酸—乙腈为流动相,利用UPLC,通过比较对照品的保留时间和最大吸收波长,对益气摄血方化学成分进行定性分析。2.益气摄血方入血、入脾成分研究:SD大鼠以高剂量(4.14 g/kg)灌胃给药益气摄血方,每天两次,连续给药三天。取材后经蛋白质沉淀等前处理,采用UPLC-MS/MS分析技术对益气摄血方给药大鼠血浆和脾脏进行检测。通过设定质谱条件和比较保留时间对益气摄血方入血和入脾成分定性分析。3.益气摄血方治疗ITP的作用机制研究:以益气摄血方入血成分和ITP相关靶点为研究对象,通过网络药理学的研究方法建立益气摄血方成分—靶点网络、成分靶点蛋白互作网络、ITP相关靶点蛋白互作网络、益气摄血方治疗ITP的预测靶点网络,最后通过对预测得到的靶点进行GO和KEGG分析,探讨益气摄血方治疗ITP的作用机制。结果:1.通过UPLC分析,建立了益气摄血方特征图谱,并在特征图谱上指认了 10个益气摄血方化学成分,分别为:没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H和苯甲酰芍药苷。2.通过UPLC-MS/MS分析方法,鉴定了 23个益气摄血方入血成分和11个入脾成分。入血成分有人参皂苷Rbi、Re、Rd、Rc、Rb2、Rb3、Rg1,地黄苷D,梓醇,5-羟甲基-2-呋喃甲酸,益母草苷,异甘草素,异甘草苷,甘草次酸,茯苓酸,芍药苷,氧化芍药苷,洋川芎内酯Ⅰ,洋川芎内酯H,阿魏酸,绿原酸,正丁基苯酞,白术内酯Ⅲ。入脾成分为人参皂苷Rb1、Re、Rd、Rc、Rb2、Rb3、Rg1,异甘草苷,5-羟甲基-2-呋喃甲酸,洋川芎内酯Ⅰ,阿魏酸。.3.利用网络药理学的方法分析益气摄血方的活性化合物及其治疗靶标,通过GO和KEGG富集分析探讨益气摄血方治疗ITP的机制。在生物过程中,基因表达负调控、细胞内蛋白代谢和细胞黏附等排位靠前;在细胞组件中,主要涉及核质、细胞质和蛋白复合物等;在分子功能中,蛋白质结合、泛素蛋白连接酶结合、和转录因子结合等排在前面。在KEGG分析中,Neurotrophin信号通路、B细胞受体信号通路、PI3K-Akt信号通路,MAPK信号通路和NF-kappaB信号通路排名靠前。结论本研究建立了中药益气摄血方特征图谱,为益气摄血方质量控制提供方法依据;鉴定了 23个益气摄血方入血成分和11个入脾成分,为益气摄血方药效物质基础的进一步研究奠定了基础;网络药理学的结果表明,益气摄血方可能通过调控基因表达、细胞内蛋白代谢和细胞黏附等生物过程,并涉及核质、细胞质和蛋白复合物等细胞组件发挥治疗ITP的作用,其机制可能与Neurotrophin、B细胞受体和PI3K-Akt等信号通路有关。