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目的:研究血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolarepithelialtypeⅡcells,AEC-Ⅱ)的直接作用,并探讨HO-1预处理对过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)致AEC-Ⅱ氧化损伤的影响。
方法:免疫粘附法分离纯化SD大鼠AEC-Ⅱ,台盼蓝(trypanblue)拒染法鉴定细胞活性,碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)法鉴定细胞纯度,倒置显微镜和电镜观察细胞形态和特征性结构。①观察HO-1对原代培养AEC-Ⅱ的直接作用。细胞随机分为7组:A1组(正常对照组);B1组(H2O2组,0.5mmol/LH2O2);C1组(0.01μmol/LHO-1);D1组(0.1μmol/LHO-1);E1组(1μmol/LHO-1);F1组(10μmol/LHO-1);G1组(50μmol/LHO-1)。②观察HO-1预处理对原代培养AEC-Ⅱ氧化损伤的影响。细胞随机分为6组:A2组(正常对照组);B2组(H2O2组,0.5mmol/LH2O2);C2组(0.01μmol/LHO-1+0.5mmol/LH2O2);D2组(0.1gmol/LHO-1+0.5mmol/LH2O2);E2组(1μmol/LHO-1+0.5mmol/LH2O2);F2组(10μmol/LHO-1+0.5mmol/LH2O2)。细胞分别接种于24孔、96孔培养板中,培养24h处理组加入HO-1,26h加入H2O2诱导氧化损伤,培养至29h观察细胞形态、细胞计数和用四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)测定细胞光密度值(opticaldensity,OD)。
结果:①免疫粘附纯化的方法可收获AEC-Ⅱ2~2.5×107个/鼠,活性和纯度均>90%;电镜下可见AEC-Ⅱ特征性结构--嗜锇性板层小体(lamellarbody,Lb)。②培养AEC-Ⅱ至29h,H2O2组与正常对照组比较贴壁细胞数量减少,差异有统计学意义(P<0.05),细胞体积减小,胞内可见反光增强的空泡,大量细胞脱壁,上清液中可见较多的细胞碎片。③0.01~50μmol/LHO-1各处理组与正常对照组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义(P>0.05),细胞形态无明显改变;④0.1~10μmol/LHO-1+0.5mmol/LH2O2组与正常对照组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义(P>0.05),
细胞形态无明显改变:分别与H2O2组和0.01μmol/LHO-1预处理组比较细胞计数减少、OD值降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:①免疫粘附法纯化AEC-Ⅱ可收获细胞2~2.5×107个/鼠,纯度和活性均>90%;0.5mmol/LH2O2诱导AEC-Ⅱ氧化损伤3h,细胞形态改变明显,是一种较好的获得AEC-Ⅱ氧化损伤模型的方法;②0.01~50μmol/LHO-1对原代培养的AEC-Ⅱ没有直接的细胞毒性;③0.1~10μmol/LHO-1预处理对H2O2致离体原代培养大鼠AEC-Ⅱ氧化损伤起保护作用。