【摘 要】
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针对酶热稳定性的改造一直是蛋白质工程中研究的热点之一。传统的蛋白质工程如定向进化往往以低筛选效率为代价得到符合工业需求的变体。近年来,基于计算机辅助的多种计算设计策略的发展为酶的热稳定性改造提供了更多的思路。本文中以来自奇异变形杆菌的脂肪酶（Proteus mirabilis lipase,PML）作为模式蛋白,基于其结构信息和序列信息,利用两种不同多重计算策略提高其热稳定性,以期进一步拓展其在工
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针对酶热稳定性的改造一直是蛋白质工程中研究的热点之一。传统的蛋白质工程如定向进化往往以低筛选效率为代价得到符合工业需求的变体。近年来,基于计算机辅助的多种计算设计策略的发展为酶的热稳定性改造提供了更多的思路。本文中以来自奇异变形杆菌的脂肪酶（Proteus mirabilis lipase,PML）作为模式蛋白,基于其结构信息和序列信息,利用两种不同多重计算策略提高其热稳定性,以期进一步拓展其在工业上的应用,同时为其他生物酶的工业改造提供更省时省力的选择。主要研究结果如下:（1）奇异变形杆菌脂肪酶的异源表达。将含有奇异变形杆菌脂肪酶基因的p ET28a（+）-PML质粒转化至大肠杆菌。对PML的酶活和热稳定性进行表征,35℃下以对硝基苯酚月桂酸酯为底物测量其比活为33.48 U·mg-1,Tm为49.96℃。（2）策略1:基于能量和进化提高PML的热稳定性。首先选择了3种基于互补算法的软件ABACUS,PROSS以及Fold X为正筛对PML进行计算设计,选择其两两交集,利用PSSM序列保守性分析和GREMLIN共进化分析两种负筛进一步缩小突变文库,得到18个单点突变设计。经实验验证,有7个Tm提高的突变体。选择其中5个酶活高于野生型的突变体利用贪婪累积策略进行组合,最终五点组合突变体MA10的Tm提高了10.63℃,相对酶活为野生型的140%。（3）策略2:针对PML柔性区域的改造。通过对不同温度下分子动力学模拟的比对及PML的B-factor,确定PML的柔性位点,进一步结合Rosetta自由能计算及进化获得22个单点突变设计。经验证,获得了8个热稳定性提高的突变体,其中G206E的ΔTm达到5.19℃。对其中四个单点突变进行组合得到的MB6的Tm提高了12.47℃,相对酶活为野生型的180%,G206E、E207A、K208G三个单点的协同作用是其热稳定性提高的主要原因。在MB6上再次整合策略1中独有的两个突变获得MC,其热稳定性提高了13℃,相对酶活达野生型的180%。对MB6及MC的有机溶剂耐受性进行表征,PML及其突变体对甲醇等六种常用的有机溶剂表现出良好的耐受性。（4）对组合突变体MA10及MB6进行分子动力学模拟。分子动力学模拟表明MA10及MB6在突变位点及附近区域有新的作用力产生,206-208号残基附近作用力的重排可能稳定了对PML稳定性有关键作用的Ca2+结合位点。
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