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目的:通过检测Graves病患者外周血中IL-9及其相关因子,探讨IL-9与Graves病的关系。在体外,通过TGF-β与IL-4联合诱导CD8~+T细胞,检测CD8~+T细胞中IL-9~+细胞比例,并对CD8~+IL-9~+T细胞的表型进行初步研究。方法:(1)分离人外周血单个核细胞(PBMC),PMA+Ionomycin刺激5h,采用PCR方法,从人PBMC获得IL-9基因片段,克隆至pMD18-T载体,转化E.coli DH5α宿主菌,经PCR、酶切及测序鉴定为阳性质粒后,制备pMD18-T-IL-9标准质粒,建立IL-9 mRNA的实时荧光定量PCR检测方法。(2) 23例Graves病患者及21例健康对照者外周血标本来自镇江市第一人民医院。分离Graves病患者及健康对照者PBMC,采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测PBMC中IL-9、IL-10、IL-4的相对表达水平。并对IL-9与IL-10,IL-4的相关性进行分析。酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测疾病组及健康对照组血浆IL-9浓度。疾病组及健康对照组PBMC经体外诱导后,采用流式细胞术检测CD4~+IL-9~+T细胞及CD8~+IL-9~+T细胞的比例。(3)以CD3单抗OKT-3包被细胞培养板,在TGF-β及IL-4条件下培养健康志愿者的PBMC,采用流式细胞术检测CD8~+T细胞中产生IL-9的比例,定量检测其细胞因子的变化,并对IL-9~+CD8~+T胞的表型进行初步分析。结果:(1)建立了人IL-9的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r~2为0.995-0.998,线性范围为(10~2～10~7)copies/μl,融解曲线分析扩增产物为单峰。(2) Graves病患者组PBMC中IL-9、IL-10、IL-4mRNA表达水平均明显高于健康对照组(P＜0.05)。其中IL-9相对表达量为1.83(四分位数间距,IQR 1.01-4.3),高于健康对照组0.30(IQR 0.04-1.80)(p＜0.05);疾病组IL-10表达量为0.92(IQR 0.28-1.60),高于健康对照组0.03(IQR 0.02-0.20)(P＜0.05):疾病组IL-4表达量为28.70(IQR14.64-54.65),高于健康对照组4.47(IQR 0.70-17.81)(P＜0.05)。(3) IL-9mRNA与IL-10mRNA表达呈明显正相关(R=0.6861,P＜0.01),而与IL-4 mRNA表达无相关性。(4)ELISA检测结果显示,GD患者血浆IL-9(n=23,250±205pg/ml)呈高表达,与健康对照组(n=20,120±50pg/ml)相比差异明显(P＜0.05)。(5)PBMC经TGF-β1与IL-4体外诱导后,与健康对照组(n=12)相比,GD组(n=14)CD4~+T细胞中产IL-9细胞的比例明显升高(1.15±0.49%vs 2.13±0.88%,P＜0.05);GD组(n=14,3.0±0.57%)中CD8~+T细胞中IL-9阳性细胞的比例也高于健康对照组(n=12,1.01±0.40%)(P＜0.05)。(6)在CD3单抗刺激下,TGF-β与IL-4可诱导CD8~+T细胞产生IL-9;诱导条件下细胞高水平表达转录因子GATA-3及C-maf,流式检测表明IL-9~+CD8~+T细胞表达IFN-γ的阳性率为46%,颗粒酶-B的阳性率为100%。结论:(1)本研究提示GD患者体内IL-9及相关细胞因子表达水平明显增高。(2)体外成功诱导出产生IL-9的人CD8~+T细胞,表型分析显示此细胞亚群表达INF-γ和颗粒酶-B。