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心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)是心血管病中一个重要的病理生理过程。它涉及许多临床常见疾病和情况,包括冠状动脉痉挛、心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后溶栓或介入治疗、冠状动脉旁路移植术、体外循环下心脏手术以及心脏骤停后心肺复苏等。其机制并未完全明确,除了与氧自由基、钙超载、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞等有关因素外,也研究发现与细胞膜离子通道的功能调节有关,但目前确切的作用与机制尚不清楚。故有必要深入探讨心脏I/RI的离子通道作用和机制,为临床I/RI的相关疾病提供新的、有效的保护措施。近年来,研究发现细胞膜内外离子交换的自稳态与凋亡的发生密切相关,在细胞凋亡过程的早期,必然出现细胞体积的减小即凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease,AVD),被认为是一个重要的细胞凋亡的形态学特征。这个过程必然伴有钾、氯离子与水的外流,膜片钳证实细胞凋亡伴有氯离子电流激活,在各种因子诱导细胞凋亡的研究中发现,阻断激活的氯离子通道可抑制细胞体积的减小和细胞凋亡的发生。本课题组前期在细胞水平上,证明了氯离子通道在STS(Staurosporine)及模拟I/RI诱导的原代心肌细胞凋亡模型中,参与并介导了心肌细胞凋亡的发生,阻断其通道能有效的挽救细胞凋亡的发生。然而,在更加接近生命本质的器官及整体动物水平上,情况如何呢?目前国外学者仅有的两篇结果完全相反的研究报道,孰是孰非?尚无定论。本课题正是基于以前期研究的基础与近期国际上研究的矛盾结果为出发点,进一步在整体动物水平上探讨氯离子通道在心肌细胞凋亡过程中的作用。研究目的在整体动物水平上制备心肌I/RI的动物模型,从心脏功能、再灌注心率失常、氧化应激水平、心肌酶学及心肌细胞凋亡等指标,观察DIDS(4,4’-disothiocyanostibibene-2, 2’-disulfonic acid)是否具有保护受损心肌细胞的作用及可能的机制,为氯离子通道阻断剂能够有效的预防I/RI心肌提供新的实验依据。研究方法1.心脏I/RI的模型的制备:为摸索最佳实验条件,据不同I/R时间将成年SD大鼠随机分成4组。A组:假手术组,仅以丝线在冠脉左前降支深部穿过,不结扎;B组:缺血30 min/再灌注4 h组,以丝线从冠脉左前降支深部穿过并结扎,结内置松解线,30min后抽出松解线,松开活结实现再灌注,4h;C组:模型制作方法同B组,缺血30 min/再灌注12 h组;D组:模型制作方法同B组,缺血30 min/再灌注24 h组。在B、C和D组中确定最佳I/RI心肌模型条件。2.实验分组:将成年SD大鼠随机分成5组。A组:假手术组;B组:I/R组;C组:I/R+ DIDS(7 mg/kg)组;D组:I/R+ DIDS(14 mg/kg)组;E组:I/R+DIDS(28 mg/kg)组。再灌注即刻经股静脉以程控微量泵给予DIDS 2 h(4 ml/kg/h)。3.观察指标:①在I/R前、后观察心电图变化,再灌注期间进行心率失常评分;②于结扎前、缺血后、再灌注后用多导生理仪记录心脏血流动力学指标:左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末期压(left ventricular end dilated pressure,LVEDP)、心室收缩期室内压上升最大速率(+dp/dtmax)和心室舒张期室内压下降最大速率(-dp/dtmax)的变化;③再灌注后测定各组血浆肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、丙二醛(malon- dialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性;④DNA“梯”状条带(DNA–ladder)、TUNEL(Terminal deoxynucl- eoside transferase mediated dUTP nick end labelling)法测定细胞凋亡;⑤Evans’blue-TTC法测量MI范围。研究结果1.成功制备大鼠心脏I/R模型:经开胸手术,通过结扎与松开冠状动脉,再灌注结束时对心肌组织行Evans’blue染色,观察发现非缺血心肌组织染成蓝色,缺血心肌组织未染色;缺血心肌组织经TTC染色,观察发现存活的心肌染成砖红色,梗死心肌为苍白色。缺血30 min/再灌注4 h为检测心肌细胞凋亡的最佳条件,缺血30 min/再灌注24 h是检测MI范围的最佳条件。为本课题深入的研究打下了良好的基础。2. DIDS可降低缺血30 min/再灌注4 h心脏心律失常积分:再灌注期间,在假手术组、I/R组、DIDS 7 mg/Kg组、DIDS 14 mg/Kg组、DIDS 28 mg/Kg组的心律失常积分值分别是1.20±0.45、4.57±1.62、3.97±1.51、3.23±1.13、3.56±1.47。表明DIDS可明显抑制再灌注期心律失常(n=5,P <0.05),尤以DIDS 14 mg/Kg组为显著(n=5,P <0.01)。3. DIDS可改善缺血30 min/再灌注4 h心脏血流动力学指标:①与假手术组相比,I/R组LVEDP明显升高而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显下降(n=5,P <0.05);②与I/R组相比,DIDS各组均对+dp/dtmax和-dp/dtmax均有明显改善;DIDS 14 mg/kg组对LVSP、LVEDP有明显改善(n=5,P <0.05)。4. DIDS可减少缺血30 min/再灌注4 h损伤导致的外周血清CK、LDH活性,与I/R组相比,DIDS组LDH和CK活性明显降低(n=5,P<0.05)。5. DIDS能使缺血30 min/再灌注4 h损伤心肌组织中MDA含量明显下降,心肌组织内SOD活性水平显著提高(n=5,P<0.05)。6. DIDS可显著减少缺血30 min/再灌注4 h损伤心肌细胞的凋亡:TUNEL及DNA-ladder检测显示:与假手术组相比,I/R组和DIDS组心肌细胞凋亡明显增加(n=5,P<0.05);但与I/R组相比,DIDS组心肌细胞凋亡显著减少(n=5,P<0.05),DIDS 14 mg/kg组减少最为明显(n=5,P<0.01)。7. DIDS可显著降低缺血30 min/再灌注24 hMI范围:心肌染色显示DIDS组MI范围比I/R组明显减少(n=5,P<0.05)。结论1.成功制备了大鼠心脏的I/R模型,缺血30 min/再灌注4 h为检测心肌细胞凋亡的最佳条件,缺血30 min/再灌注24 h是检测MI范围的最佳条件。2.证实DIDS对I/RI心肌具有明显的保护作用。可能机制是DIDS通过抑制受损心肌细胞氯离子的向外流动,减轻脂质过氧化反应及改善自由基清除酶SOD的活性,从而减少心肌细胞凋亡的发生,减少心律失常发生,缩小MI范围,改善了心脏的收缩和舒张功能。3. DIDS 14 mg/kg组对I/RI心肌的保护作用最为明显。能明显抑制再灌注心律失常,减少心肌细胞凋亡,改善LVSP、LVEDP。