论文部分内容阅读
兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV)引起的兔的一种急性、败血性、高度接触性传染病,以致死性和全身实质器官出血为主要特征。RHDV是杯状病毒科成员,结构简单,在兔体内可以诱导机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答,还有极强的诱导干扰素产生的能力。RHDV仅有一个主要结构蛋白VP60, VP60在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)、这种病毒样颗粒具有良好的免疫原性,本身可作免疫佐剂,通过胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。有研究证实这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,或作为疫苗载体。为了探究兔出血症病毒样颗粒(RHDV-VLPs)容纳外源表位的能力,了解其适宜的外源片段插入位点,探索嵌合VLPs的组装及其免疫原性,初步评价RHDV VLPs作为外源表位展示系统的可行性,本研究在RHDV衣壳蛋白VP60的C末端插入OVAT细胞抗原表位,将VP60的502-510位、411.417位、302-309位氨基酸分别替换为OVAT细胞抗原表位(鸡源卵清蛋白OVA257-264位氨基酸,序列SIINFEKL),通过杆状病毒表达系统构建4种重组兔出血症病毒样颗粒(RHDV-VLPs),通过电镜观察和动物实验,研究外源片段对VLPs的组装及免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1.重组穿梭载体的构建通过PCR,在RHDV VP60基因序列的特定区域直接插入OVA CD8+T细胞表位(SIINFEKL),或通过SOE法对RHDV VP60基因序列的特定区域进行部分缺失并用OVA CD8+T细胞表位(SIINFEKL)替换,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定后,将目的片段连接至真核表达载体pFastBacl,并对目的片段进行测序,测序正确的重组质粒转化DH10Bac菌,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组质粒,分别命名为Bacmid-V-579、Bacmid-V-502-510、 Bacmid-V-411-417、Bacmid-V-302-309。2.蛋白表达及鉴定将获得的阳性重组质粒转染Sf9细胞。逐日观察,当出现明显的细胞病变时,收获病毒rBac-v-579、rBac-v-502-510、rBac-v-411-417、rBac-v-302-309.提取细胞内总RNA进行RT-PCR扩增,阳性样品作为重组杆状病毒原液进行扩增和传代,并通过间接免疫荧光试验(IFA)、血凝试验(HA)、蛋白质电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)等鉴定嵌合蛋白vp60-ova/579、 vp60-ova/502-510、vp60-ova/411-417、vp60-ova/302-309的表达。RT-PCR结果证实4组目的基因mRNA在转染的细胞中发生转录；IFA结果显示4种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳结果显示,4种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,大小约为60kDa；Western-blot结果显示,4种嵌合蛋白均能被RHDV单抗A3C特异性识别,证明4种嵌合蛋白的载体具有良好的反应原性；此外,血凝实验结果显示4种嵌合蛋白中,vp60-ova/579和vp60-ova/302-309有血凝性, vp60-ova/502-510和vp60-ova/411-417血凝性消失。3.嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性分析对4种嵌合蛋白进行浓缩纯化及定量分析,通过电镜观察嵌合蛋白形成病毒样粒子的能力。将4种纯化定量的嵌合蛋白(vp60-ova/579. vp60-ova/502-510. vp60-ova/411-417和vp60-ova/302-309),免疫接种7-8周龄C57BL/6雌性小鼠,设VP60、OVA多肽、无菌PBS为对照,各免疫三次,间隔两周,每只小鼠每次免疫40μg蛋白,分别在未免、二免后2周及三免后2周采集小鼠血清,间接ELISA测定0d、28d、42d血清中VP60抗体水平,试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α含量。结果显示：4种嵌合蛋白中,vp60-ova/579、vp60-ova/502-510、 vp60-ova/411-417及vp60-ova/302-309均可形成VLPs,大小约为40nm,形态与天然兔出血症病毒样粒子类似。4种嵌合蛋白均可诱导小鼠产生不同程度的针对VP60载体的体液免疫应答和针对OVAT细胞表位的细胞免疫应答。其中,vp60-ova/579能引起较低的针对VP60的体液免疫应答和较高的针对OVA T细胞表位的细胞免疫应答。初步推测,VP60579位氨基酸可能是4个位点中携带外源T细胞表位的较优位点。本实验构建了携带CD8+T细胞表位的VP60嵌合蛋白。该T细胞表位来自鸡源卵清蛋白OVA257-264(SIINFEKL),受MHC I类分子限制。T细胞表位分别嵌合在RHDV VLP的不同位置：1)直接插入VP60的C末端,即第579位aa之后；2)取代VP60502-510位氨基酸；3)取代VP60411-417位氨基酸；4)取代VP60302-309位氨基酸。嵌合RHDV病毒样粒子作为载体的研究结果表明,四组嵌合蛋白不同程度的诱发VP60特异性体液免疫应答和针对OVAT细胞表位的细胞免疫应答。本研究为以RHDV VLPs为载体的疫苗研究提供理论依据。