【研究背景及目的】在全球范围内,肺癌是罹患人数最多的恶性肿瘤,也是导致死亡数最多的癌症类别。目前,以放疗、化疗和分子靶向治疗为主的治疗虽然具有一定的疗效,但由于较高的转移率和复发率,长期以来患者的预后和生存率一直无明显提高。因此,临床上迫切需要寻找有效治疗肺癌的新策略。近年的研究认为肿瘤组织是由异质性的细胞群体构成,这些细胞处于不同的分化阶段,具有不同的性质和功能,其中有一小部分细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,可以驱动肿瘤的发生、发展、侵袭和转移,对放化疗不敏感,这一小部分细胞被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）或肿瘤发生细胞。CSCs主宰着肿瘤分化、癌细胞增殖、自我更新及血管形成等诸多方面,如果能够有效抑制CSCs,就可以从源头上阻断恶性肿瘤的发生发展。三氧化二砷（arsenic trioxide,As₂O₃）是砒霜的有效成分,在中国有数千年的用药历史。近年来,研究者发现As₂O₃通过降解PML-RARα融合蛋白,诱导急性早幼粒白血病细胞干细胞分化,使患者获得较高的完全缓解率（65-84%）,并且无明显骨髓抑制等毒副作用,已获美国FDA批准用于治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）。Hong等发现As₂O₃与PI3K抑制剂PI-103联合应用能减少急性髓性白血病干细胞的数量。此外,多项临床前研究证实As₂O₃可以通过影响与干细胞功能密切相关的Hedgehog通路或Notch通路,从而抑制神经胶质瘤、肝癌及胰腺癌中的CSCs。在肺癌领域,我们课题组前期研究发现As₂O₃的抗肺癌机制是多靶点的:As₂O₃可诱导肺癌细胞凋亡,促进肺癌细胞G1期阻滞;As₂O₃可抑制肺癌血管形成;在动物模型水平,As₂O₃可使肿瘤组织中出现腺腔以及粘液分泌的特异性组织结构,降低Ki-67的表达,提示其可能具有诱导肺癌分化的作用。但是目前关于As₂O₃对肺癌干细胞的影响尚不清楚。本课题将研究As₂O₃对肺癌干细胞的影响,并探讨可能的作用机制。【实验方法】第一部分As₂O₃对肺癌干细胞的影响一、As₂O₃对肺癌细胞增殖的影响分别用0、1、2、4、8和16μmol/L的As₂O₃处理肺癌细胞24、48或72h,利用CCK8试剂盒检测细胞增殖活性。二、As₂O₃对肺癌细胞在体外形成克隆的影响分别用0、1、2和4μmol/L的As₂O₃处理肺癌细胞72h,随后每组均取出2×10³细胞接种于6孔板,连续培养2w,观察克隆形成情况。三、As₂O₃对肺癌细胞形成肿瘤球的影响分别用0、1、2和4μmol/L的As₂O₃处理肺癌细胞72h,随后每组均取出1×10⁴细胞重悬于成球培养液,4-7d后在倒置显微镜下观察并拍照。四、As₂O₃对干细胞表面标志CD133表达的影响分别用0、1、2和4μmol/L的As₂O₃处理肺癌细胞72h,进行qPCR、Western blot及流式细胞仪技术检测CD133的表达情况。五、As₂O₃对干细胞功能相关分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表达的影响分别用0、1、2和4μmol/L的As₂O₃处理肺癌细胞72h,进行q PCR和Western blot检测Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4在mRNA及蛋白水平的表达情况。第二部分As₂O₃对肺癌干细胞的作用机制分别用0、1、2和4μmol/L的As₂O₃处理肺癌细胞72h,进行qPCR、Western blot检测Hedgehog通路的信号分子Ptch、Smo、Gli1、Gli2、N-myc及GAS1在m RNA及蛋白水平的表达情况。【研究结果】第一部分As₂O₃对肺癌干细胞的影响一、As₂O₃对肺癌细胞增殖的影响1、As₂O₃对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响As₂O₃可明显抑制A549细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。As₂O₃处理A549细胞72h,IC₅₀为10.860μM。2、As₂O₃对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460增殖的影响As₂O₃可明显抑制NCI-H460细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。As₂O₃处理NCI-H460细胞72h,IC50为5.610μM。3、As₂O₃对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1增殖的影响1、2、4、8或16μmol/L的As₂O₃作用于SK-MES-1细胞24h、48h或72h均不能显著抑制SK-MES-1细胞增殖（P>0.05）。4、As₂O₃对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446增殖的影响As₂O₃可显著抑制NCI-H446细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。As₂O₃处理NCI-H446细胞72h,IC50为4.252μM。二、As₂O₃对肺癌细胞在体外形成克隆的影响1、As₂O₃对人肺腺癌细胞株A549在体外形成克隆的影响CCK8结果提示As₂O₃可明显抑制A549、NCI-H460和NCI-H446增殖,但SK-MES-1对As₂O₃不敏感,故我们用A549、NCI-H460和NCI-H446进行后续实验。结果显示:在A549细胞株中,As₂O₃处理组形成的克隆数与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2、As₂O₃对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460在体外形成克隆的影响2和4μmol/L As₂O₃可明显抑制NCI-H460细胞在体外形成克隆（P<0.001）,而1μmol/L As₂O₃处理组形成的克隆数与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3、As₂O₃对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446在体外形成克隆的影响1、2和4μmol/L As₂O₃均可显著抑制NCI-H446细胞在体外形成克隆（P<0.001）。三、As₂O₃对肺癌细胞形成肿瘤球的影响1、As₂O₃对人肺腺癌细胞株A549形成肿瘤球的影响各As₂O₃处理组形成肿瘤球的数量与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。As₂O₃处理组形成肿瘤球的大小与对照组比较也无明显差别。2、As₂O₃对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460形成肿瘤球的影响1、2和4μmol/L As₂O₃均可明显抑制NCI-H460细胞形成肿瘤球（P<0.001）,且随着As₂O₃作用浓度的增加,这种抑制作用更加明显。3、As₂O₃对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446形成肿瘤球的影响1、2和4μmol/L As₂O₃均可明显抑制NCI-H446细胞形成肿瘤球（P<0.01）,且呈浓度依赖性。四、As₂O₃对干细胞表面标志CD133表达的影响1、As₂O₃对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460中干细胞表面标志CD133表达的影响以上实验结果说明As₂O₃对NCI-H460和NCI-H446中的CSCs的抑制效果较明显。因此,后续实验我们仅用NCI-H460及NCI-H446作为研究对象。结果显示:1、2和4μmol/L As₂O₃均可下调NCI-H460细胞中干细胞表面标志CD133在m RNA及蛋白水平的表达,且呈浓度依赖性。2、As₂O₃对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446中干细胞表面标志CD133表达的影响1、2和4μmol/L As₂O₃均可下调NCI-H446细胞中干细胞表面标志CD133在m RNA及蛋白水平的表达,且呈浓度依赖性。五、As₂O₃对干细胞功能相关分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表达的影响1、As₂O₃对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460中干细胞功能相关分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表达的影响qPCR结果提示As₂O₃可使NCI-H460细胞中Oct4和Sox2 m RNA的表达明显下降。但As₂O₃处理组C-myc、nanog、β-catenin及Klf4基因的表达与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。western blot结果提示As₂O₃可抑制Oct4和Sox2蛋白的表达。2、As₂O₃对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446中干细胞功能相关分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表达的影响qPCR结果提示As₂O₃可显著抑制NCI-H446细胞中Oct4和Sox2 m RNA的表达,且呈浓度依赖性。但As₂O₃处理组C-myc、nanog、β-catenin及Klf4基因的表达与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果提示As₂O₃可抑制Oct4和Sox2蛋白的表达。第二部分:As₂O₃对肺癌干细胞的作用机制一、As₂O₃下调人大细胞肺癌细胞株NCI-H460中Hedgehog通路信号分子的表达As₂O₃可使NCI-H460细胞中Hedgehog通路信号分子Smo、Gli1、Gli2、N-myc和GAS1 m RNA及蛋白的表达明显下降。但As₂O₃不能影响Ptch受体的表达。二、As₂O₃下调人小细胞肺癌细胞株NCI-H446中Hedgehog通路信号分子的表达As₂O₃可使NCI-H446细胞中Hedgehog通路信号分子Smo、Gli1、Gli2、N-myc和GAS1 mRNA及蛋白的表达明显下降。但As₂O₃不能影响Ptch受体的表达。【结论】1、As₂O₃可抑制人大细胞肺癌细胞株NCI-H460和人小细胞肺癌细胞株NCI-H446中的肿瘤干细胞。2、As₂O₃通过下调与肺癌干细胞功能密切相关的Hedgehog通路来抑制肺癌干细胞。