论文部分内容阅读
背景:银屑病(Psoriasis)是一种常见的慢性炎症性皮肤病,以炎症浸润、表皮棘皮病和角化过度为特征。银屑病的发病机制复杂,现有的研究结果尚不能完全解释。目前普遍认为银屑病是由多种原因包括遗传、表观遗传和环境影响等共同作用的结果。银屑病的皮损表现为角质细胞过度增殖和分化不全,炎症细胞浸润,毛细血管增生等。最近的研究表明银屑病主要是由树突状细胞(Dendritic cell,DC)和T细胞介导的,朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)作为特殊的DC,是皮肤的特异性抗原提呈细胞,通过连接模式识别受体感知病原体相关分子,产生多种细胞因子,并携带抗原呈递给T细胞,诱导特异性T细胞反应,DC失调引起的T细胞异常激活被认为是多种疾病特异性免疫反应的原因,如银屑病。中医药认为治疗银屑病应“从血论治,从燥论治”,各方名家基于此理论,针对其特性总结出的疗法疗效可靠,毒副作用少。银屑灵是国医大师禤国维教授根据多年临床经验总结出的验方,方中主要有赤芍、土茯苓、肿节风、莪术和乌梅五味中药,诸药合用可养血润燥,凉血解毒,化瘀通络,在临床上取得了可靠的疗效。前期研究显示银屑灵可促进表皮颗粒层的形成,减轻小鼠瘙痒程度以及小鼠皮肤风团的面积,还能够抑制巨噬细胞极化,但是就银屑灵对LC及T细胞的调控研究较少,因此本实验从LC和T细胞方面对银屑灵的免疫调节机制进行研究。目的:探讨银屑灵对朗格汉斯细胞和T辅助细胞的调节作用及机制;并进一步对银屑灵的主要有效成分花旗松素治疗银屑病的疗效和对T辅助细胞的作用及机制进行研究。方法:1.Balb/c小鼠银屑病模型的建立及银屑灵疗效的观察Balb/c小鼠随机分为6组,包括空白组、模型组、环孢素A组和银屑灵高、中、低组,并剃掉小鼠背部2/3的毛发。小鼠灌胃给药7天,银屑灵高、中、低剂量组给药浓度分别为1.5g/kg、1g/kg、0.5g/kg,环孢素A组为2mg/mL,均按照0.2mL/10g的剂量给药,空白组和模型组给同等剂量的水。给药第三天开始于背部均匀涂抹5%咪喹莫特(IMQ)50mg,连续涂抹5天,每日记录体重。造模第二天开始观察小鼠背部红斑、鳞屑和增厚等症状,并对其进行PASI评分;造模第六天取背部皮肤进行HE病理切片,观察皮损病理变化,并结合PASI评分和体重变化评价银屑灵药效。2.银屑灵对LC的调控作用研究小鼠灌胃给药五天,第四天开始涂抹IMQ造模,第六天深度麻醉后,颈椎脱臼处死,取皮肤和淋巴结分离表皮细胞和淋巴细胞,采用流式对表皮及淋巴细胞中LC的表达情况进行检测分析。3.银屑灵对T细胞的作用研究小鼠灌胃给药七天,第三天开始涂抹IMQ造模,第八天深度麻醉后,颈椎脱臼处死,皮肤做病理切片,观察银屑灵对银屑病CD3+CD4+T细胞浸润的影响;采用RT-PCR检测皮肤中Th1/Th2/Th17细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17a以及转录因子T-bet、GATA3和ROR γt的表达;采用流式细胞术检测淋巴细胞和表皮细胞中T细胞相关细胞因子和转录因子的表达,观察银屑灵对银屑病表皮T细胞产生细胞因子以及淋巴结T细胞分化的影响。4.银屑灵主要有效成分花旗松素对银屑病的作用及机制研究利用LPS诱导HaCat细胞异常增殖,观察花旗松素对Hacat细胞异常增殖的作用;小鼠按照TXL组40mg/kg,CsA组2mg/mL灌胃给药七天,第三天开始用50mg 5%IMQ造模,第八天深度麻醉后,颈椎脱臼处死,皮肤做病理切片观察皮肤厚度,层数以及炎性细胞浸润程度;采用RT-PCR和流式细胞术对皮损和淋巴结中Th1/Th2/Th17的细胞因子及其转录因子进行检测分析;皮肤提取蛋白做Western Blot检测,探讨TXL缓解银屑病症状的分子机制。结果:1.Ba1b/c小鼠背部连续涂抹50mg 5%咪喹莫特五天,其背部出现严重红斑、鳞屑和增厚等银屑病症状,PASI评分达到11.00±0.82,皮肤厚度275.54±14.64μM,体重增加率-8.87%±1.63%。而银屑灵给药后银屑病样皮损明显缓解,中剂量组PASI评分降低至6.25±1.71(P<0.05),体重增加率-2.39%±1.72%(P<0.01),表皮厚度也明显变薄148.97±6.60 μM(P<0.001),说明银屑灵能够有效缓解银屑病临床症状和病理症状。2.流式结果显示,银屑灵组PU.1和LC的表达均显著降低(P<0.001),说明银屑灵可以抑制表皮LC和PU.1的表达,但不影响淋巴结中DC的表达水平(P>0.05);另外银屑灵组迁移至淋巴结的LC 比值为2.17±2.47%,而IMQ组为40.60±7.66%,说明银屑灵能够抑制LC从表皮迁移至淋巴结(P<0.001),同时,检测结果还表明银屑灵能够抑制LC发挥抗原提呈作用(P<0.05),因此银屑灵可能通过抑制LC的迁移及其抗原提呈作用来缓解银屑病。3.银屑灵降低了银屑病皮损CD3+CD4+T细胞的浸润,降低了促炎因子IL-17a和IFN-γ的表达(P<0.05),同时促进了抗炎因子IL-4的分泌(P<0.05);淋巴结中T细胞流式结果显示,银屑灵对TCR β+T细胞和CD4+T细胞的比值作用不明显(P>0.05),但是显著降低了产生IL-17a的 γδ+T细胞的表达(P<0.05);另外银屑灵抑制了 Th1细胞和Th17细胞的主要细胞因子IL-17a和IFN-γ的分泌(P<0.001),但是对其转录因子ROR γT和T-bet影响不明显(P>0.05),相反对Th2细胞因子IL-4及其转录因子GATA3有明显的促进作用(P<0.01),因此银屑灵可能通过促进抗炎性Th2细胞反应,同时抑制促炎性Th1和Th17细胞而发挥治疗作用。4.花旗松素能够有效抑制LPS诱导的HaCat细胞的异常增殖(P<0.001),并能够有效缓解小鼠银屑病样临床及病理症状(P<0.05)。花旗松素降低了促炎因子IL-17a和IFNγ及其转录因子ROR γt和T-bet的表达(P<0.01),同时对抗炎因子IL-4及其转录因子GATA3有明显促进作用(P<0.001)。Western Blot结果显示,花旗松素能够抑制Notch1,RBPJK,JAK2和p-stat3的表达(P<0.05)。因此,TXL可能通过调节Notch1通路和JAK2/stat3通路促进抗炎因子IL-4及其转录因子GATA3的表达,降低了促炎因子IL-17a和IFN γ及其转录因子ROR γt和T-bet的水平,从而起到缓解银屑病的作用。结论:1.灵可有效缓解银屑病临床及病理症状,降低其PASI评分,有效恢复体重;2.灵明显降低LC及其转录因子PU.1的表达,抑制LC的迁移及其抗原提呈作用;3.著降低小鼠皮损CD3+CD4+T细胞的浸润,促进淋巴结Th2细胞的分化,同时抑制Th1和Th17细胞的分化;4.松素可有效抑制LPS诱导的HaCat细胞异常增殖,缓解银屑病临床及病理症状,通过抑制Notch1和JAK2/STAT3通路促进Th2细胞,同时抑制Th1和Th17细胞的表达。