【摘 要】
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在肽科学发展中,固相合成(SPPS)的观念和方法已经广泛用于化学、生物学等领域,直接导致了多肽和核酸的自动化合成,也催生了组合化学的诞生及其广泛应用。多肽合成的难点在于氨基酸的不同功能基团易于发生副反应,从而引起副产品增多、分离纯化困难、合成效率降低等现象,因此用于多肽合成的氨基酸的活性基团必须在进行肽合成之前暂时保护起来,以保证多肽合成过程按照所需序列顺利进行。本文以多肽合成方法为指导,确立并优
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在肽科学发展中,固相合成(SPPS)的观念和方法已经广泛用于化学、生物学等领域,直接导致了多肽和核酸的自动化合成,也催生了组合化学的诞生及其广泛应用。多肽合成的难点在于氨基酸的不同功能基团易于发生副反应,从而引起副产品增多、分离纯化困难、合成效率降低等现象,因此用于多肽合成的氨基酸的活性基团必须在进行肽合成之前暂时保护起来,以保证多肽合成过程按照所需序列顺利进行。本文以多肽合成方法为指导,确立并优化了组氨酸和半胱氨酸的保护策略,在此基础上用Fmoc-SPPS法合成了非标记和部分15N标记的血管紧张素Ⅱ,并对其进行了纯化处理和相应的分析。
1.通过单因素考察、中心曲面实验设计和正交实验设计主要对His的两步保护反应条件进行优化,合成了组氨酸(His)的保护产物Fmoc-His(Trt)-OH,最终两步反应收率分别都达到80%以上,产品纯度达到95%以上。
2.通过单因素考察确定了较优的半胱氨酸(Cys)的侧链保护产物H-Cys(Tn)-OH合成的溶剂体系,在Fmoc-His(Tn)-OH的优化实验条件基础上,合成了Cys的保护产物Fmoc-Cys(Trt)-OH,其收率和纯度也都分别达到了80%以上和95%以上。
3.实验中为合成多肽的需要,还成功合成了非标记和15N标记的无侧链保护的氨基酸衍生物Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Val-OH,并经紫外扫描,熔点测定,质谱和HPLC分析得以确证。同时实验还制备了载量适中的氨基酸与树脂的偶联产物Fmoc-Phe-Wang树脂。
4.采用Fmoc固相合成法(SPPS)成功合成了非标记和部分15N标记(带标记的氨基酸为Phe、Pro、Ile、Val)的8肽—血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),其氨基酸残基序列为Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe。
5.对非标记AngⅡ合成实验条件做了单因素考察,确定合适的反应时间和反应物用量配比,最后得到粗产品的收率为80%以上,用HPLC半制备柱纯化处理,经HPLC分析、MS、氨基酸序列分析鉴定合成产物。结果表明:纯化后产品纯度达到98%以上;质谱测得非标记和部分15N标记产品分子量分别为1046和1050,与理论分子量相符;氨基酸序列测定为Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe,与设计序列一致。
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