论文部分内容阅读
目的：奶牛无浆体病是黑龙江省近几年奶牛经常发生的"无名高热病"之一，主要发生于5～10月份，常与其他几种类症病相混淆，给临床诊断带来困难。为了对该病进行深入的研究，首先分离鉴定A.marginale地方分离株；建立PCR快速诊断方法，并初步应用于黑龙江省奶牛无浆体病的流行病学调查；利用己鉴定的A.marginale分离株，构建A.marginale主要表面蛋白-5的编码基因(msp5)的原核表达载体，并获取目的蛋白，为无浆体病血清学诊断方法的建立以及亚单位疫苗研究奠定基础。
方法：(1)在黑龙江省大庆市、安达市、嫩江市和齐齐哈尔市等地区奶牛场，采集有典型"无名高热病"病症状奶牛血液样本，用PCR方法扩增A.marginale msp5基因并克隆测序，把测序结果与兰州株A.marginale以及GenBank中的6株A.marginale msp5基因序列进行同源性比较，绘制系统进化树，分析其系统发生关系。(2)根据A.marginale高度保守的msp5基因设计一对特异性引物，以兰州株和上述鉴定的A,marginale分离株为参照，建立无浆体病PCR快速诊断方法，应用该方法对黑龙江省部分地区奶牛无浆体病的流行情况进行调查。(3)选择有代表性的Amarginale分离株(Amarginale str.HQ)为模板，用具有限制性内切酶BamH I与Sal I位点的引物扩增msp5编码序列，将目的DNA片段插入到原核表达载体pQE30构建表达质粒pQE30-msp5，转化到.E.coli XLl-Blue后，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE鉴定。融合蛋白用Anti-His-Tag单克隆抗体进行Western blot鉴定。融合蛋白用电洗脱方法纯化后免疫新西兰雄兔，制备特异性抗血清，与rMSP-5和从病牛血液中纯化的A.marginale分别进行Western blot鉴定其免疫原性。
结果：(1)从临床样本中扩增出来的DNA片段序列与兰州株A.marginale msp5基因序列同源性均高于99.5％，与GenBank中的6株A marginale msp5基因序列同源性均不低于95.8％，从而确定从样本中扩增出的DNA片段是A.marginale msp5片段。(2)本实验建立的奶牛无浆体病PCR.快速诊断方法与牛巴贝斯焦虫、双芽巴贝斯焦虫、附红细胞体、大肠杆菌和健康牛血液之间无交叉反应，可检测的被感染最少红细胞数约为200个，可用于潜伏期和感染后携带牛的检测。对奶牛无浆体病流行病学调查结果表明，A.marginale是黑龙江省部分地区奶牛"无名高热病"的病原之一。(3)应用限制性内切酶BamH I与Sal I对重组质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定获得pQE30-msp5，用IPTG诱导pQE30-msp5在Ecoli XLl-Blue中表达出目的蛋白，与Anti-His-Tag单克隆抗体进行Western blot鉴定是融合蛋白，rMSP-5免疫新西兰雄兔产生了高效价抗体，在Western blot中该抗体能与自然的MSP-5发生特异性反应。
结论：1、从黑龙江省分离鉴定了4株A.marginale。2、建立了奶牛无浆体病PCR快速诊断方法。3、成功构建了A.marginale msp5的重组表达载体pQE30-msp5，并在大肠杆菌中高效表达出融合蛋白rMSP-5，该蛋白与野生A.marginale MSP-5具有相同的抗原性。