背景与目的滋养细胞来源于形成中胚泡的滋养内胚层,是胚泡中最先分化的细胞。滋养细胞的增殖、分化、凋亡和程序性侵入是胚胎发育、胎盘形成及胎儿生长所必需的。滋养细胞的功能异常可导致子痫前期/子痫、不明原因的流产、胎儿生长受限等妊娠相关性疾病以及葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌等妊娠滋养细胞疾病(Gestational trophoblastic diseases,GTD)的发生。因而,对滋养细胞功能的调控机制的深入研究,有利于阐明妊娠相关性疾病以及妊娠滋养细胞疾病的发病机制,并对这些疾病的防治有重要的意义。研究滋养细胞增殖、分化、凋亡和程序性侵袭行为的调控因素已成为目前妇产科学研究热点,但确切的调控机制至今尚未阐明。调控因素很多,也很复杂。如何将这些错综复杂的调控因素有机地统一起来一直是困扰我们的难题。但不管通过何种因素起作用,其最初都是先出现某个基因或某组基因的改变,最终通过细胞信号传导途径来引起滋养细胞功能的变化。基因印迹(gene imprinting)是指体细胞来源于不同亲代的一对等位基因发生的差异性表达,它是一种不遵从经典的孟德尔遗传规律的依靠单亲传递某些遗传学性状的现象。正常的基因印迹在功能上与胎儿及胎盘的发育、细胞分化和增殖等有关。基因印迹异常(如印迹丢失、杂合性丢失、单亲二倍体等现象)与某些特殊的遗传性疾病及肿瘤的发生密切相关。其中印迹基因H19作为最早发现的印迹基因之一,是一种母系表达,父系沉默的印迹基因,又是一种非编码RNA,其转录产物不编码蛋白,而是在RNA水平发挥作用。但H19确切的作用机制目前仍未能完全阐明。有学者认为它是原癌基因,也有学者认为它是抑癌基因。因此,H19可能在细胞的增殖、分化和侵袭方面具有双重作用。印迹基因H19的不同作用取决于不同的组织类型以及不同的发育阶段,即H19基因具有组织特异性及发育阶段特异性。然而,目前的文献报道仍然无法明确在滋养细胞中H19到底是抑癌基因还是原癌基因。我们既往的研究结果发现H19的印迹状态在胎盘滋养细胞的发育过程中存在着动态变化,而这个动态变化的节点是在孕10周,恰好和滋养细胞的第一次侵袭高峰的时间非常一致。因此,我们有理由推测:印迹基因H19在滋养细胞节制性侵袭行为(或程序性侵袭行为)的调控中可能发挥着关键性的作用。我们既往的研究发现H19在45%的子痫前期胎盘组织中呈印迹丢失(Loss of imprinting,LOI),在正常晚孕胎盘组织中均呈印迹状态;然而在子痫前期胎盘组织中H19 RNA表达水平与正常晚孕胎盘组织却无差异。H19的印迹状态与H19 RNA表达水平的不一致也在很多肿瘤组织的研究中被认识到。H19的表达水平除了印迹或甲基化的调控方式外,可能还存在着其他的调控方式或者负反馈的保护作用。那么,H19到底是通过印迹状态的改变起作用还是通过RNA表达水平的变化起决定性作用,或者是两种方式均产生作用,目前仍不清楚。我们之前采用DNA甲基化转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷作用于人滋养细胞株JEG-3细胞后发现,H19启动子区域呈现低甲基化状态,H19 RNA表达明显上调,滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力下降。虽然前期的实验可以证明H19启动子区域甲基化水平的高低可直接影响H19的表达水平,但是由于5-杂氮脱氧胞苷的甲基化抑制效应是广谱的,而缺乏特异性,因此,药物作用不仅引起H19基因的表达改变,还可能影响其它基因的印迹状态和表达水平。目前尚没有针对H19的甲基化转移酶抑制剂的药物。因此,为了进一步阐明或明确H19的表达水平对滋养细胞功能的影响,本研究拟通过人全长H19cDNA重组真核表达载体和H19-RNA干扰慢病毒载体的构建来深入探讨H19过表达和低表达对滋养细胞功能的影响;同时探讨H19通过哪些相关的信号传导分子来影响滋养细胞的功能以及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达状况,为印迹基因H19调控滋养细胞功能改变的分子机制的阐明奠定基础,为子痫前期的发病机制的阐明提供新的线索。本研究的主要结果和结论如下:1.滋养细胞株JEG-3细胞和JAR细胞以及正常胎盘滋养细胞H19的表达水平非常丰富,而且H19-RNA干扰慢病毒载体感染后不影响细胞形态学的改变,因此,采用H19-RNA干扰慢病毒载体构建H19低表达模型的方法优于含人全长H19cDNA重组真核表达质粒pRc/CMV的H19过表达模型,更适合用于H19在滋养细胞中的功能研究。H19-RNA干扰慢病毒载体的成功构建,为后续的H19的功能研究奠定了基础。2.H19干扰后可抑制JAR细胞的凋亡,使JAR细胞周期阻滞在G1期,而不影响JAR细胞侵袭力以及细胞基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9,MMP-9)mRNA的表达,提示H19不是直接通过影响滋养细胞的侵袭力,而是通过参与调节滋养细胞的增殖和凋亡过程来影响滋养细胞的生物学功能。3.分别采用含人全长H19cDNA重组真核表达质粒pRc/CMV转染的方法和H19 RNA干扰的方法均证实了在人绒癌滋养细胞株中H19表达水平的改变不能直接调控胰岛素生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)的表达水平。H19的过表达可下调JEG-3细胞HES1和双特异性磷酸酶5(dual specificity phosphatase 5,DUSP5)mRNA的表达,H19低表达可上调JAR细胞的HES1和DUSP5 mRNA的表达,提示HES1和DUSP5在H19调控滋养细胞的生物学功能中可能起着重要的信号传导作用。4.结合子痫前期H19呈印迹丢失状态以及重度子痫前期胎盘组织IGF2、HES1mRNA表达水平均较正常晚孕胎盘组织明显降低,H19可调节HES1和DUSP5的表达的研究结果推测:在妊娠早期H19印迹丢失导致H19过表达,从而使HES1和DUSP5表达受阻,引起滋养细胞的分化障碍、促进滋养细胞的凋亡,最终导致滋养细胞功能异常,从而参与子痫前期的发病。5.不管H19是过表达还是低表达都不影响内吞蛋白(EGFR pathway substrate15,EPS15)mRNA的表达变化,提示EPS15在H19调控滋养细胞的生物学功能中并不起重要作用;重度子痫前期胎盘组织EGFR及EPS15表达水平与正常晚孕胎盘组织比较也无明显改变,提示EGFR及EPS15不是参与调节表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)水平以及重度子痫前期发病的重要信号分子。本研究工作是探索H19在滋养细胞中的生物学功能以及对下游信号传导分子的影响的一次尝试,为进一步的表观遗传学研究奠定了良好基础,为开拓H19的新功能的研究提供了有益的信息,为阐明滋养细胞相关性疾病的发病机制和防治策略提供了新的视角。