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镇江香醋是常用的调味品,不仅含有多种风味物质,还富含川芎嗪等具有保健功效的生物活性物质,川芎嗪具有降血脂、解痉挛、抗氧化、镇静催眠、抗肝纤维化等功效,本论文以川芎嗪及其前体(主要为乙偶姻)为研究对象,探讨其在醋酸发酵过程中的微生物合成机制,以期为食醋功能物质微的产生机制开拓新思路,为研究食醋活性物质发酵工艺、开发富含川芎嗪的保健品等诸方面奠定理论基础。本论文主要研究结论如下:(1)在镇江香醋醋酸发酵过程中,乙偶姻与双乙酰含量分别在第0-20天、第7-16天呈急速上升趋势;川芎嗪从第15天开始被检测到,并呈明显上升趋势。在原位发酵环境中添加各川芎嗪前体物质(丙酮酸、磷酸氢二铵、亮氨酸、乙偶姻、双乙酰),验证了醋醅微生物群落合成川芎嗪及其前体的功能特性,且乙偶姻、双乙酰及铵离子是川芎嗪合成的重要前体物质,其中双乙酰由双乙酰还原酶(DR)催化生成乙偶姻的途径相对较弱。(2)利用克隆文库法对醋醅中乙偶姻合成途径中三个关键酶的基因多样性进行研究:采用CODEHOP方法针对三种酶的编码基因分别设计简并引物,其特异性及兼容性均良好,以醋醅总基因组为模板,扩增出明亮、单一且大小正确的条带,经克隆测序后构建克隆文库,文库覆盖率(Coverage C)和稀缺性曲线均显示乙酰乳酸合成酶(ALS)文库与DR文库可较好反映出原位群落中对应基因的种属分布情况,而乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)文库多样性略差;聚类分析与进化分析结果显示,醋醅中丙酮酸到乙偶姻的合成主要是由Acetobacter及Lactobacillus通过催化丙酮酸→α-乙酰乳酸→乙偶姻途径而共同完成,两属之间ALS和ALDC的基因功能互补可能达到了合成乙偶姻的目的;另外,醋醅中DR催化双乙酰→乙偶姻的合成能力较弱,其主要由Bifidobacterium indicum、L.fermentum及少量低丰度微生物完成。(3)根据克隆文库结果选取六株乙偶姻功能菌株,在原位/异位发酵条件下进行单独/混合培养。A.pasteurianus G3-2在原位/异位环境下单独发酵均不可产生乙偶姻(或极少量);异位环境下,L.buchneri F2-5、L.casei 10M1-5、L.reuteri 26M17-3分别与A.pasteurianus G3-2混合发酵后,乙偶姻产量相对于其单独发酵时均有不同程度的提高;原位环境下,L.fermentum 37M10-3在与A.pasteurianus G3-2混合发酵后,乙偶姻产量相对于单独发酵时有明显的提高。实验结果说明,不同乳酸菌与A.pasteurianus在特定条件下进行混合发酵,可以提高乙偶姻产量,二者在乙偶姻合成途径中可实现功能互补的作用,验证了克隆文库的结论。