杏仁蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的酶法制备

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高血压病已成为人类健康的第一杀手。据报道,全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超过1200万,预防和治疗高血压病是当今社会十分重要的课题。血管紧张素转化酶(AngiotensinⅠ-Converting Enzyme, ACE)在血压调节中起着重要作用。目前用于降血压的药物,其降压原理主要是抑制ACE的活性。食物蛋白源ACE抑制肽因其安全性高,副作用小,易吸收,成为活性肽研究领域的热点,这些ACE抑制肽在开发具有降血压功能的功能性食品中具有广阔的应用前景。杏仁是蔷薇科李属植物——杏(Prunus armeniaca L.)的种子,脱苦、脱苷的杏仁是一类优质的植物蛋白资源,其氨基酸组成平衡合理,营养价值较高,研究杏仁蛋白的开发利用是促进我国杏仁产业健康发展、实现杏仁加工产业化不可忽视的一个方面。本文以陕西铜川产苦杏仁为原料,主要从以下几个方面对杏仁蛋白及其ACE抑制肽进行了研究:一是确定了杏仁蛋白的碱溶酸沉提取工艺,采用冷冻干燥法制备杏仁蛋白,并对其性质进行了研究;二是采用6种商业蛋白酶水解杏仁蛋白,利用高效液相色谱法对水解产物的ACE抑制活性进行检测,确定了为得到具有较好ACE抑制效果的水解物的最佳酶系;三是采用Alcalase碱性蛋白酶对杏仁蛋白进行酶解,对酶解条件进行了研究,得到最佳酶解工艺;四是通过超滤对ACE抑制肽进行了分离分级,对不同分子量大小杏仁多肽的ACE抑制活性进行了研究。研究结果表明:1、基于二次回归正交旋转组合设计试验,杏仁蛋白碱溶酸沉提取法最佳工艺参数为:碱溶pH值10.0,料液比(g/mL)1:13,提取温度45℃。在此条件下提取时间30min,重复提取两次,提取率可达87.58%。然后在pH为4.5时进行酸沉,将沉淀水洗至中性并冷冻干燥,得到的杏仁蛋白粉中粗蛋白含量为80.73%。2、按照WHO建议的以鸡蛋蛋白质所含氨基酸比例为参考标准,杏仁蛋白的氨基酸评价分数为69,其氨基酸组成丰富,氨基酸分数高,组成平衡合理,是一类优秀的蛋白质资源。3、根据Osborne法分级测定,杏仁蛋白中清蛋白含量较高,达85%以上,其次是球蛋白,约为6%,而醇溶蛋白、谷蛋白等含量较少。4、杏仁蛋白的等电点为pH=4.5左右。在等电点时其溶解度最低,在强酸强碱pH条件下,其溶解度较大。5、采用Protamex、Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、Proleather FG-F、木瓜蛋白酶等六种蛋白酶对杏仁蛋白冻干粉进行水解,利用RP-HPLC测定水解物对ACE的抑制活性,以水解度(DH)和水解产物对ACE的抑制率为指标对酶解过程进行了分析。结果表明,Alcalase碱性蛋白酶对杏仁蛋白有较好的水解效果,其水解物对ACE抑制率较高,当水解物浓度为2.5mg/mL时,ACE抑制率为74.62%。6、以酶解温度、酶底比、底物浓度、pH值为指标对碱性蛋白酶Alcalase酶解杏仁蛋白工艺进行了优化,为得到较大活性的ACE抑制肽,最佳水解条件为:pH值7.0,温度50℃,酶底比([E]/[S])2%,底物浓度2%。该条件下经60min水解,其水解物的ACE抑制活性较高,此时的水解度为12.23%,得到的水解物对ACE的IC50为0.38mg/mL。7、经截留分子量5KDa、1KDa的超滤膜对Alcalase酶解得到的杏仁多肽进行分级分离,结果发现,不同分子量范围的多肽均对ACE活性有抑制作用,其ACE抑制率随分子量的减小而增大。分子量低于1KDa的杏仁多肽的ACE抑制活性最高,其IC50为0.167mg/mL。8、采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析法测定ACE抑制肽(<1KDa)的分子量,结果主要得到一个洗脱峰,所对应的分子量范围为173.3~411.3Da。9、氨基酸分析结果显示,ACE抑制肽的疏水性氨基酸含量较高。ACE抑制肽的溶解性较好,溶解度接近100%。10、经体外模拟胃肠消化后,杏仁蛋白ACE抑制肽仍保持较高抑制活性。
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