条锈菌重要效应子PstGSRE1毒性基序鉴定及其靶标TaLOL2介导的抗病功能解析

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小麦(Triticum aestivum L.)是人类赖以生存的谷类作物,条锈病是小麦上常发性的生物灾害之一,严重危害小麦产量及品质。条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst)作为一种活体营养型寄生菌,通过吸器分泌多种效应子来调节寄主防卫反应。因此,研究条锈菌效应子功能及其调控的寄主免疫反应,有助于深入解析病原菌致病机理,并为创制新的持久抗条锈病材料提供理论依据。前期研究发现,条锈菌富含甘氨酸和丝氨酸效应子PstGSRE1及其保守基序m9通过阻止小麦转录因子TaLOL2进核从而干扰寄主免疫。基于此,本研究进一步探究了PstGSRE1-m9的毒性基序及其与靶标TaLOL2的关键互作区段,创制了TaLOL2过表达材料进行抗性鉴定,并对其调控的下游候选基因进行了初步解析,获得如下结果。1.首先对效应子PstGSRE1保守基序m9的50个氨基酸进行点突变和分段突变,借助农杆菌系统将21个突变蛋白在烟草中瞬时过表达,进一步明确了PstGSRE1-m9的甘氨酸及丝氨酸不发挥毒性功能,第11-17位氨基酸(PstGSRE1-m9-M7)为其毒性基序。借助荧光素酶互补技术将14个m9的突变体与靶标TaLOL2进行互作验证,发现PstGSRE1-m9与TaLOL2的互作需要甘氨酸及丝氨酸的参与。进一步利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证了PstGSRE1-m9-M7为m9和TaLOL2互作的关键区段。2.利用条锈菌生理小种CYR22、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和CYR34对TaLOL2过表达材料进行抗病性鉴定。与对照相比,过表达株系对条锈菌CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和CYR34均产生了抗性表型。通过组织学观察与统计,发现过表达株系中条锈菌侵染点附近H2O2积累面积显著增大,菌丝生长受到明显抑制。qRT-PCR结果表明,在条锈菌侵染过程中,病程相关基因TaPR1和TaPR2及活性氧生成相关基因TaNOX在转基因株系中相对表达量显著提高,而活性氧清除相关基因TaSOD和TaCAT3的表达受到明显抑制,进一步证实了TaLOL2为小麦抗条锈病的正向调节因子。借助于DAP-seq技术,获得了TaLOL2结合的候选调控基序,初步发现条锈菌侵染过程中TaLOL2正向调控下游抗病相关基因的转录。综上所述,PstGSRE1-m9-M7为效应子PstGSRE1的关键调控基序,TaLOL2正向调控小麦对条锈菌的抗性及下游抗病相关基因的转录。为锈菌杀菌剂新靶点的发掘提供了良好的候选,为条锈病持久绿色防控提供了重要的理论依据。
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