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研究目的:由乙型肝炎病毒持续感染引起的慢性乙型肝炎及继发的肝硬化和肝癌是威胁人类健康的重大疾病。α干扰素(Interferon-α,IFN-α)是目前治疗乙肝的一个主要方法,但在临床治疗中缺乏广谱的疗效。黏病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A,MxA)是干扰素诱导的重要抗病毒蛋白,其具有不依赖干扰素信号且独立抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的功能,但其抗HBV的作用机制尚未被充分阐明。我们前期研究发现,MxA蛋白通过与病毒核心蛋白(hepatitis B core protein,HBc)相互作用抑制HBV复制,我们推测MxA可能对HBV核衣壳的组装有抑制作用。本研究将进一步阐明MxA蛋白抑制HBV复制的分子机制,这为研发抗HBV新药提供了靶点和理论支持,同时,此项研究也将为突破现今干扰素治疗不应答的瓶颈提供新的技术手段和依据。研究方法:以HepG2.2.15细胞为病毒模型,将Flag空载、Flag-MxA、突变体Flag-MxAK83A和突变体Flag-MxAL612K分别转染HepG2.2.15细胞,利用Western印迹法检测核心抗原蛋白HBc表达情况,用实时荧光定量PCR技术检测核衣壳内pgRNA的量。透射电镜观察在HuH7细胞中单转Flag-HBc、共转Myc-MxA与Flag-HBc核心颗粒的形态。将Myc-MxA分别与Flag-HBc和突变体Flag-HBc-Y132A共转染HuH7细胞,利用免疫共沉淀法检测相互作用。以Myc-MxA为模板构建缺失突变体ΔCID(central interactive domain)和截短体CID,分别将空载质粒、MxA、ΔCID和CID转染HepG2.2.15细胞免疫荧光法检测转染效率,Western印迹法检测质粒表达情况,酶联免疫法测定细胞上清液中HBsAg、HBeAg及荧光定量PCR法测定上清液中HBV DNA的量,鉴定CID段的抗乙肝病毒活性。根据CID段的晶体结构,分别构建A1、A2、A3等9段肽段质粒,鉴定各段的抗乙肝病毒活性。运用计算生物学手段—分子对接法预测MxA蛋白与病毒相互作用的区域和位点。根据筛选结果构建缺失突变体,检测突变体的抗病毒活性,以此鉴定MxA蛋白上与HBc相互作用关键区段。研究结果:野生型Flag-MxA、突变体Flag-MxAK83A和突变体Flag-MxAL612K较空载对照组HBc含量无明显变化,较pgRNA的量显著下降(P<0.01)。透射电镜结果显示,与单转HBc组相比,MxA表达组核衣壳出现明显聚集、变形。免疫共沉淀结果显示,MxA蛋白能与HBc共沉淀也能与HBc-Y132A共沉淀,两者均与MxA蛋白有相互作用。ΔCID、CID和9段肽段质粒的测序及表达正确。CID组和MxA组较空载对照组HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量均显著降低(P<0.01),ΔCID组较对照组无明显变化。9段肽段中A1较对照HBsAg、HBeAg及HBV DNA的量下降最显著(P<0.001)。分子对接的结果显示,MxA蛋白上与病毒HBc蛋白的互作位点集中在384-408位氨基酸,该区域落在A1肽段上。Δ384-408组与空白组相比,抗病毒活性无明显变化,差异无统计学意义。研究结论:MxA蛋白对HBV的核心蛋白HBc的表达无影响;MxA蛋白阻碍HBV核衣壳的组装;MxA蛋白主要通过与未组装的核心蛋白HBc相互作用来抑制核衣壳的组装;MxA蛋白可能主要以A1区段与核心蛋白HBc的相互作用来阻碍核衣壳的装配,从而抑制病毒复制。