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针对肿瘤发病机制中的特定细胞信号转导通路、激酶和蛋白进行抗肿瘤药物设计有利于提高药物的药效和选择性。NQO1是真核细胞内普遍存在的一类黄素蛋白酶，它可以通过去电子还原反应参与体内多种醌类的代谢和醌类药物的生物激活过程。由于NQO1在多种实体肿瘤细胞中的表达远高于正常细胞，并具有独特的生物活化醌类化合物的特性，NQO1成为抗肿瘤药物研究的分子靶标之一。以NQO1为靶点的生物还原药物、触发性前药和抑制剂在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
天然邻醌化合物β-拉帕醌(β-lap)是一典型的NQO1的生物还原药物。在NQO1的介导下，通过醌-氢醌-醌氧化还原循环过程，产生大量的自由基(ROS)。高浓度的ROS将严重破坏肿瘤细胞的氧化还原微环境，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。NQO1的结合位点主要由Trp105、Tyr126、Tyr128、Phe106，Gly150、Gly149等残基和辅酶FAD组成的平面活性口袋和Tyr128、His161、Phe236和Met131等残基组成的侧位疏水口袋构成。分子对接研究发现，β-lap虽能有效的嵌入到NQO1活性口袋中，但只占据了与FAD平行的底部口袋，并没有占据Tyr128、His161、Phe236和Met131等残基形成的侧位口袋。另外，β-lap的吡喃环为一个相当不稳定的结构，易水解开环形成有毒的代谢产物，这也影响了它作为抗癌药物的进一步开发。为增加β-lap的稳定性和NQO1靶向性，发现新型NQO1生物还原药物，本研究以β-lap为先导化合物，进行以下三个部分的研究工作。
一、4-取代邻萘醌并己内酰胺类NQO1生物还原药物的设计合成与活性评价。在β-lap结构基础上，通过引入己内酰胺环代替β-lap的吡喃环，以增加β-lap衍生物的稳定性。在己内酰胺的4位引入各种类型的取代基，通过与NQO1侧位口袋的结合，以增强化合物的NQO1靶向性，设计了30个4-取代-3，4-二氢苯并[h]喹啉-2，5，6-三酮类化合物。以1，2-萘醌为起始原料，通过叠氮三甲基硅烷，在其4位引入氨基。该中间体再与醛、米氏酸、乙酸在回流条件下反应，合成了目标化合物BL1-BL30。通过NQO1活性实验、分子对接模拟和肿瘤细胞增殖抑制实验，探讨了该类化合物的构效关系。其中，4-羟基-3-甲氧基苯基(BL14)、3-羟基-4-甲氧基苯基(BL15)和2-氟苯基(BL10)是4-位取代的优选基团。化合物BL15具有较强NQO1活性和抗肿瘤细胞增殖活性，能使HepG2肿瘤细胞的有丝分裂停滞于S/G2期，诱导肿瘤细胞凋亡。进一步作用机制研究表明，化合物BL15通过ROS的生成增多，导致细胞内氧化还原失衡，引起线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡。在HepG2肿瘤异种移植瘤动物模型中，静脉给药BL15，能有效抑制肿瘤的生长。在20mg/kg时，其对肿瘤的生长抑制率达50.3％。与溶媒组相比，所有实验小鼠的体重变化不明显，说明该化合物毒性较低。
二、3-(1-苯并三唑)-nor-β-拉帕醌类NQO1生物还原药物的设计合成与活性评价。Nor-β-拉帕醌(nor-βMap)是β-lap的去甲类似物，它对多种肿瘤细胞具有较强的抗增殖活性，而对正常细胞具有较低的毒性，具有一定的选择性。Nor-β-lap可参与NQO1依赖的氧化还原循环反应，通过ROS的生成途径，诱导肿瘤细胞的调亡。分子对接模拟发现，nor-β-lap能有效的嵌入NQO1活性口袋中，与黄素腺嘌呤二核苷酸的异吡嗪形成有效的π-π键结合，但并没有占据由Met131、Met154、Phe236、Tyr128和His161残基生成的侧位口袋。因此，为增强nor-β-lap衍生物与侧位口袋的结合，以nor-β-lap的结构为基础，在其3位引入苯并三氮唑取代基，设计、合成了12个3-(1-苯并三唑)-nor-β-拉帕醌类化合物。通过NQO1活性实验、分子对接模拟和肿瘤细胞增殖抑制实验，探讨了该类化合物的构效关系。在nor-β-lap的3位引入5-丁基苯并三氮唑时，化合物NB11的活性最好。NB11使HepG2肿瘤细胞的有丝分裂停滞于G0/G1期，诱导肿瘤细胞凋亡。作用机制研究表明，化合物NB11通过ROS的生成增多，导致细胞内氧化还原失衡，引起线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡。在HepG2肿瘤异种移植瘤动物模型中，静脉给药NB11，能有效抑制肿瘤生长。在20mg/kg时，其对肿瘤的生长抑制率为52.3％，而对实验小鼠的体重没有明显影响。
三、β-拉帕醌-单星素类NQO1生物还原药物的设计合成与活性评价。单星素是第一个小分子Eg5蛋白抑制剂，能特异性的结合Eg5蛋白并抑制其功能，诱导增殖的肿瘤细胞停滞在于有丝分裂期，促进细胞凋亡。本研究采用药效团拼合理念，通过将β-lap的1，2-萘醌核和单星素的四氢嘧啶硫酮部分拼合，设计、合成了一系列β-拉帕醌-单星素杂合分子。这些杂合体对NQO1高表达的HepG2和A549细胞具有较强的抗增殖活性，而对NQO1低表达的H596和LO2细胞的活性较低。在NQO1抑制剂双香豆素存在下，该类化合物对A549的抗增殖活性降低，说明NQO1介导的生物还原活化过程与其抗增殖活性密切相关。NQO1活性测试和分子对接模拟表明，化合物BM9是NQO1的良好底物，通过NQO1介导的ROS氧化应激途径，诱导细胞凋亡。在HepG2肿瘤异种移植瘤动物模型中，静脉给药BM9，能有效抑制肿瘤生长。在20mg/kg时，其对肿瘤的生长抑制率为58.7％，而对实验小鼠的体重、行为等没有明显影响。。
综上所述，本研究以β-lap、nor-β-lap类为先导化合物，设计、合成了4-取代邻萘醌并己内酰胺类、3-(1-苯并三唑)-nor-β-拉帕醌类和β-拉帕醌-单星素类氧化还原循环型NQO1生物还原药物，并对代表性化合物进行了NQO1活性、分子对接模拟、肿瘤细胞增殖抑制活性和相关的作用机制研究，发现了三个具有优良体内外抗肿瘤活性的NQO1生物还原药物BL15、NB11和BM9。这三个化合物的NQO1活性高于β-lap或nor-β-lap，并在一定程度上提高了该类化合物的靶向性和细胞选择性，为进一步进行结构优化和发现候选化合物奠定一定的基础。
天然邻醌化合物β-拉帕醌(β-lap)是一典型的NQO1的生物还原药物。在NQO1的介导下，通过醌-氢醌-醌氧化还原循环过程，产生大量的自由基(ROS)。高浓度的ROS将严重破坏肿瘤细胞的氧化还原微环境，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。NQO1的结合位点主要由Trp105、Tyr126、Tyr128、Phe106，Gly150、Gly149等残基和辅酶FAD组成的平面活性口袋和Tyr128、His161、Phe236和Met131等残基组成的侧位疏水口袋构成。分子对接研究发现，β-lap虽能有效的嵌入到NQO1活性口袋中，但只占据了与FAD平行的底部口袋，并没有占据Tyr128、His161、Phe236和Met131等残基形成的侧位口袋。另外，β-lap的吡喃环为一个相当不稳定的结构，易水解开环形成有毒的代谢产物，这也影响了它作为抗癌药物的进一步开发。为增加β-lap的稳定性和NQO1靶向性，发现新型NQO1生物还原药物，本研究以β-lap为先导化合物，进行以下三个部分的研究工作。
一、4-取代邻萘醌并己内酰胺类NQO1生物还原药物的设计合成与活性评价。在β-lap结构基础上，通过引入己内酰胺环代替β-lap的吡喃环，以增加β-lap衍生物的稳定性。在己内酰胺的4位引入各种类型的取代基，通过与NQO1侧位口袋的结合，以增强化合物的NQO1靶向性，设计了30个4-取代-3，4-二氢苯并[h]喹啉-2，5，6-三酮类化合物。以1，2-萘醌为起始原料，通过叠氮三甲基硅烷，在其4位引入氨基。该中间体再与醛、米氏酸、乙酸在回流条件下反应，合成了目标化合物BL1-BL30。通过NQO1活性实验、分子对接模拟和肿瘤细胞增殖抑制实验，探讨了该类化合物的构效关系。其中，4-羟基-3-甲氧基苯基(BL14)、3-羟基-4-甲氧基苯基(BL15)和2-氟苯基(BL10)是4-位取代的优选基团。化合物BL15具有较强NQO1活性和抗肿瘤细胞增殖活性，能使HepG2肿瘤细胞的有丝分裂停滞于S/G2期，诱导肿瘤细胞凋亡。进一步作用机制研究表明，化合物BL15通过ROS的生成增多，导致细胞内氧化还原失衡，引起线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡。在HepG2肿瘤异种移植瘤动物模型中，静脉给药BL15，能有效抑制肿瘤的生长。在20mg/kg时，其对肿瘤的生长抑制率达50.3％。与溶媒组相比，所有实验小鼠的体重变化不明显，说明该化合物毒性较低。
二、3-(1-苯并三唑)-nor-β-拉帕醌类NQO1生物还原药物的设计合成与活性评价。Nor-β-拉帕醌(nor-βMap)是β-lap的去甲类似物，它对多种肿瘤细胞具有较强的抗增殖活性，而对正常细胞具有较低的毒性，具有一定的选择性。Nor-β-lap可参与NQO1依赖的氧化还原循环反应，通过ROS的生成途径，诱导肿瘤细胞的调亡。分子对接模拟发现，nor-β-lap能有效的嵌入NQO1活性口袋中，与黄素腺嘌呤二核苷酸的异吡嗪形成有效的π-π键结合，但并没有占据由Met131、Met154、Phe236、Tyr128和His161残基生成的侧位口袋。因此，为增强nor-β-lap衍生物与侧位口袋的结合，以nor-β-lap的结构为基础，在其3位引入苯并三氮唑取代基，设计、合成了12个3-(1-苯并三唑)-nor-β-拉帕醌类化合物。通过NQO1活性实验、分子对接模拟和肿瘤细胞增殖抑制实验，探讨了该类化合物的构效关系。在nor-β-lap的3位引入5-丁基苯并三氮唑时，化合物NB11的活性最好。NB11使HepG2肿瘤细胞的有丝分裂停滞于G0/G1期，诱导肿瘤细胞凋亡。作用机制研究表明，化合物NB11通过ROS的生成增多，导致细胞内氧化还原失衡，引起线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡。在HepG2肿瘤异种移植瘤动物模型中，静脉给药NB11，能有效抑制肿瘤生长。在20mg/kg时，其对肿瘤的生长抑制率为52.3％，而对实验小鼠的体重没有明显影响。
三、β-拉帕醌-单星素类NQO1生物还原药物的设计合成与活性评价。单星素是第一个小分子Eg5蛋白抑制剂，能特异性的结合Eg5蛋白并抑制其功能，诱导增殖的肿瘤细胞停滞在于有丝分裂期，促进细胞凋亡。本研究采用药效团拼合理念，通过将β-lap的1，2-萘醌核和单星素的四氢嘧啶硫酮部分拼合，设计、合成了一系列β-拉帕醌-单星素杂合分子。这些杂合体对NQO1高表达的HepG2和A549细胞具有较强的抗增殖活性，而对NQO1低表达的H596和LO2细胞的活性较低。在NQO1抑制剂双香豆素存在下，该类化合物对A549的抗增殖活性降低，说明NQO1介导的生物还原活化过程与其抗增殖活性密切相关。NQO1活性测试和分子对接模拟表明，化合物BM9是NQO1的良好底物，通过NQO1介导的ROS氧化应激途径，诱导细胞凋亡。在HepG2肿瘤异种移植瘤动物模型中，静脉给药BM9，能有效抑制肿瘤生长。在20mg/kg时，其对肿瘤的生长抑制率为58.7％，而对实验小鼠的体重、行为等没有明显影响。。
综上所述，本研究以β-lap、nor-β-lap类为先导化合物，设计、合成了4-取代邻萘醌并己内酰胺类、3-(1-苯并三唑)-nor-β-拉帕醌类和β-拉帕醌-单星素类氧化还原循环型NQO1生物还原药物，并对代表性化合物进行了NQO1活性、分子对接模拟、肿瘤细胞增殖抑制活性和相关的作用机制研究，发现了三个具有优良体内外抗肿瘤活性的NQO1生物还原药物BL15、NB11和BM9。这三个化合物的NQO1活性高于β-lap或nor-β-lap，并在一定程度上提高了该类化合物的靶向性和细胞选择性，为进一步进行结构优化和发现候选化合物奠定一定的基础。