研究背景男性不育一直是困扰全世界的医学难题。随着社会经济的不断发展,男性的生育力却呈现不断下降的趋势,精子的数量和质量都在降低。已婚夫妇的不孕不育率高达10%,其中无精子症是男性不育的常见原因之一。无精子症的病因概括起来分为两大类型：一是睾丸本身的生精功能障碍又称为原发性无精子症或非梗阻性无精子症；二是睾丸的生精功能正常,但由于输精管道的阻塞,精子不能排出体外,这类又称为梗阻性无精子症。原发性无精子症按生精障碍程度不同又可分为唯支持细胞综合症(Sertoli cell-only syndrome SCOS)、生精细胞发育完全阻滞、Klinefelter综合症、生精功能低下等常见病理类型。其中唯支持细胞综合症是睾丸自身生精功能障碍的一个重要类型,在原发性无精子症中占有很大的比例,临床上以第二性征正常的双侧睾丸变小、无精子症、血卵泡刺激素(FSH)升高为特点。其病理特点：睾丸曲细精管生精细胞完全缺失,生精上皮仅由支持细胞组成,同时伴有管周组织轻重不等的纤维化和间质增生。以前对唯支持细胞综合症认识不足,随着睾丸活检和细胞学技术的广泛应用,其诊断率明显提高,但具体病因及发病机制不明确,治疗方法大多是经验式,治疗效果并不令人满意,相当数量的患者最终无法获得自己的后代。显然,唯支持细胞综合症临床治疗方式的突破及治疗效果的改善有赖于基础研究的重大进展,有赖于对唯支持细胞综合症机制的阐明。睾丸是男性最重要的性器官之一,具有产生精子,分泌雄激素等功能。目前对睾丸功能的研究大多停留在单基因水平和基因组水平,在揭示睾丸基因组的精细结构的同时,也凸现出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性,与睾丸功能及相关疾病多变性和复杂性之间存在着巨大反差,促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。所以有必要在生命活动的直接执行者蛋白质领域上加强对成年男性唯支持细胞综合症睾丸的功能的研究。随着人类基因组图谱的完成,一个以“蛋白质组”(proteome)为研究对象的生命科学新时代已经到来。蛋白质组是一个在时间和空间上动态变化着的整体,其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白组成成分、表达水平与修饰状态以及蛋白质之间的相互作用与联系,从而揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。1975年,O’Farrell等建立了双向凝胶电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE)。直至现在双向凝胶电泳技术(2-DE)仍然是目前蛋白质组学研究首选的蛋白质分离技术。因睾丸活检取材相对较困难,收集大量无精患者的睾丸活检标本工作量大,另外人睾丸组织标本涉及医学伦理学相关事宜,需要与患者签定知情同意书。迄今为止,国内外关于成年男性唯支持细胞综合症睾丸组织蛋白组学研究的文献尚未发现。成年男性唯支持细胞综合症睾丸组织蛋白组学的研究策略有助于获得成年男性唯支持细胞综合症相关重要功能蛋白。我们遵循医学伦理学原则并尊重患者的知情权,在获得南方医科大学南方医院伦理委员会批准后开展了成年男性无精子症睾丸活检组织标本的收集工作,并得到了多数患者的配合。建立规范和明确的成年无精男性睾丸活检组织标本收集流程,收集成年无精男性睾丸活检组织标本,依据病理诊断结果进行分组,组织库保存备用；提取成年男性唯支持细胞综合症组和生精功能正常组睾丸组织总蛋白,利用双向凝胶电泳联合质谱鉴定技术进行了成年男性唯支持细胞综合症组和生精功能正常组的比较睾丸组织蛋白组研究；筛选,鉴定成年男性唯支持细胞综合症相关重要蛋白质,并对其中的HnRNPL和PRPS2进行免疫组织化学和Western Blotting实验研究其初步功能。目的在于筛选,鉴定成年男性唯支持细胞综合症相关重要蛋白质并进一步研究其和唯支持细胞综合症发生机制的密切关系。研究方法1.样本收集成年无精子症男性睾丸活检组织样本的收集与分组：每例睾丸活检切取组织约5 mm×3mm×4mm大小,取材后立即置入冻存管中后,液氮保存.依据病理诊断结果进行分组。患者自愿捐献并签定知情同意书。本研究经南方医院伦理道德委员会批准。到开展实验为止,我们已收集样本102例,其中生精功能正常或基本正常的睾丸组织61例,轻度生精功能障碍7例,中度生精功能障碍4例,重度生精功能障碍3例,唯支持细胞综合症20例,生精细胞发育不完全阻滞4例,生精细胞发育完全阻滞1例,Klinefelter综合症2例。2.蛋白标记物的筛选2.1睾丸活检组织总蛋白的提取：随机抽取出生精功能正常组和唯支持细胞综合症组睾丸组织标本各10例,采用液氮循环冻融法提取样本总蛋白：取出冻存的睾丸组织标本,室温放置溶解,液氮冷冻,研磨成粉末后加入3～5倍体积的裂解液(7 mol／L尿素,2 mol／L硫脲,65mmol/L二硫苏糖醇,40%CHAPS,0.5% IPG缓冲液,复合蛋白酶抑制剂)后匀浆,混悬液室温放置1h以使蛋白充分溶解,14000×g 4℃离心1h,收集上清,Bradford法测定蛋白浓度,分装100μL／管,保存于-80℃冰箱备用。2.2双向凝胶电泳分离总蛋白：蛋白样品用含7M尿素,2 M硫脲,4.0%CHAPS,65 mM DTT和0.5% IPG buffer的上样缓冲液共300μL充分混合,用17cm IPG干胶条采取被动泡涨13h,等电聚焦条件为250 V 3h,500 V 1h,1000 V 1h,5 000 V 3h,10 000 V 60 KVh,500 V 3h。聚焦完毕后将胶条以胶面朝上的方式置于2.0% DTT平衡液中15 min,然后再置于2.5%碘乙酰胺平衡液中15 min,取出后放在用电泳缓冲液湿润的滤纸上以吸去表面多余的液体后,将平衡后的胶条移至0.75 mm厚浓度为10.0%的均一SDS-PAGE胶上端进行二向电泳,条件为12 mA／胶30 min,24 mA／胶恒流,直至溴酚蓝达胶底线。2.3银染40.0%乙醇,10.0%冰醋酸固定2次,每次15 min;30.0%乙醇,0.2%Na2S2O3,6.8%乙酸钠敏化30min;蒸馏水洗3次,每次5 min;2.50‰AgNO3染色20min;蒸馏水洗2次,每次1 min;2.5%Na2CO3,0.04‰甲醛显影至蛋白质点清晰;立即加入5.0%冰醋酸终止10 min；蒸馏水洗3次,每次5min;最后用30.0%乙醇,4.6%甘油保存。2.4凝胶图像扫描及分析凝胶通过UMAX PowerLook 1100投射扫描仪进行扫描获取2-DE凝胶图像,利用Melanie 4分析软件对图像进行分析,产生差异表达蛋白点数据信息。3.相关蛋白在临床无精患者睾丸组织中的表达3.1差异表达蛋白的Western Blot验证：重新选取唯支持细胞综合症组和生精功能正常组睾丸组织提取蛋白,BCA法测蛋白浓度。每孔加入约30μg蛋白,10%SDS-PAGE凝胶电泳,蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉的T-TBS室温封闭1 h,一抗稀释于封闭液中,4℃摇晃过夜,TTBS漂洗3次,二抗稀释于封闭液中,室温摇晃1 h, TTBS漂洗3次；蛋白信号由ECL化学发光试剂盒检测,压底片曝光后显影。进行灰度分析,计算待测指标与内参GAPDH灰度的比值,以检测初筛出的差异蛋白在生精功能正常和生精功能异常两组间的表达丰度差异。3.2差异表达蛋白的免疫组织化学技术验证：应用我们收集南方医院泌尿外科2005年1月-2008年10月睾丸组织活检病理石蜡标本进行研究。选择生精功能正常组和唯支持细胞综合症组中睾丸组织结构完整,色清晰的标本,对其相对应的石蜡包块,再行5μm连续切片,将切片裱于涂有3-氨基丙基三乙氧基硅胶烷(APES)的载玻片上。石蜡切片脱腊入水,接着用3%H2O2—甲醇10分钟后,水洗,再用PBS洗3次后,加生物素(Biotin)标记的特异性一抗,37℃30分钟,置湿盒内。PBS洗3次,加酶标记的卵白素(Avidin),37℃30分钟,PBS洗3次,DAB显色后,流水冲洗,复染、脱水、封片。研究结果1.对样品处理、上样量,胶条的选择等步骤进行了一系列的优化后成功地获得了人睾丸组织分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。2.对比成年男性唯支持细胞综合症组和生精功能正常组睾丸组织蛋白图谱我们共发现18个差异蛋白点,其中16个在唯支持细胞综合症组高表达,2个在唯支持细胞综合症组低表达。并对差异点进行质谱鉴定,根据质谱鉴定结果及数据库搜索发现多个蛋白表达变化可能与睾丸的生精功能有着密切的联系。3. HnRNP L和PRPS2的Western blotting结果比较发现HnRNP L在唯支持细胞综合症组中的表达水平要低于生精功能正常组,而PRPS2在唯支持细胞综合症组中的表达水平要高于生精功能正常组。通过两组的免疫组织化学结果也发现：HnRNPL在各级生精细胞细胞核及支持细胞胞核中表达,染色较正常组弱,提示HnRNPL在唯支持细胞组中表达下调。而PRPS2在各级生精细胞细胞胞浆中表达,染色较正常组强,提示PRPS2唯支持细胞组中表达上调。Western blotting结果和免疫组织化学实验结果都是与双向凝胶电泳的结果是一致的。结论1.建立了稳定性,重复性较好的人睾丸组织蛋白组双向凝胶电泳技术和方法,为其及相关疾病的蛋白质组学进一步研究奠定了基础；2.首次比较了成年男性唯支持细胞综合症组和生精功能正常组睾丸组织蛋白图谱；3.初步分析了18个差异蛋白点,其中16个在唯支持细胞综合症组高表达,2个在唯支持细胞综合症组低表达；并对其进行质谱鉴定；4. HnRNP L和PRPS2免疫组织化学和Western Blotting结果与双向凝胶电泳结果相符,为进一步研究奠定了基础。