脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞,具有来源广泛、储备量大等特点。在一定的诱导条件下,脂肪干细胞可以分化为成骨、软骨、脂肪等多种细胞。此外,脂肪干细胞还具有取材容易,适合大规模培养,对集体损伤小等优点,故逐渐成为近年来新的研究热点之一。脂肪干细胞是组织工程,尤其是骨或软骨组织损伤修复过程中重要的种子细胞,常使用深低温保存的方法来长期保持干细胞的生物学活性,以达到随需随取的目的。有研究表明,二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、海藻糖(Trehalose)和左旋肉碱(L-Carnitine)都对细胞有较好的冻存保护效果。为了建立和优化脂肪干细胞的深低温保藏技术,本实验分别以二甲基亚砜、海藻糖和左旋肉碱作为冻存剂,并对复苏后的细胞进行了活性检测分析和细胞周期检测分析,并得到以下结果:1.细胞活性检测结果表明:对照组细胞在冻存后的复苏效果优于实验组,且不同冻存剂之间的冻存效果也存在一定差异。对照组(5%DMSO+10%FBS)表现出最好的冻存效果,在进行液氮冻存1、3和7天后,其细胞在复苏24小时后的活性分别为0.413、0.267和0.218,复苏48小时后的活性分别为0.532、0.366和0.256,均高于2号(5%DMSO)、3号(5%T+10%FBS)和5号(5%L+10%FBS)实验组细胞分别在冻存复苏后的活性。2.细胞周期检测结果表明:在进行冻存复苏之后,处于G1期的细胞所占比例最大,处于G2期的细胞所占比例最小。在对处于S期的细胞进行进一步分析后发现,在对细胞进行短期冻存后(1-3d),2号实验组中处于S期细胞所占比例最大,分别为27.38%和26.34%,显著的高于对照组11.15%和17.24%。当冻存时间延长至7d后,对照组中处于S期的细胞所占比对最大,为3.35%,5号实验组与对照组效果相似,但略低于对照组,为3%。3.在培养液中加入诱导液后,会把间充质干细胞能够诱导成为成骨细胞,使用油红O染液染色,诱导成为成骨细胞能够被染成红色,红色越深或者越多,表示被诱导的细胞越多。诱导最多的是冻存剂为5%DMSO+10%FBS下冻存1天,其次是冻存剂为5%DMSO+10%FBS下冻存5天,诱导最少的是5%L+10%FBS冻存1天。4.转录组测序及生物信息学分析结果表明,在经过冻存处理之后,脂肪干细胞的基因表达谱发生变化,说明冻存处理确实会对细胞的基因表达产生影响。本实验通过检测不同冻存剂条件下细胞的复苏后的生物学特性,比较了不同冻存剂对细胞活性和细胞周期的影响,并通过转录组数据分析了5%DMSO+10%FBS冻存剂对脂肪干细胞表达谱的影响,为充分利用干细胞进行生物人工组织构建、细胞移植以及其他方面的研究奠定了一定的基础。