尿道感染(urinary tract infections,UTIs)是人类的常见疾病,40%-50%的妇女至少经历过一次尿道感染。迄今,尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是所有尿道感染中最常见的病原体。UPEC通过携带的毒力因子黏附并侵入宿主,突破宿主防御系统,引起组织损伤和宿主炎性反应。UPEC在肠道外的生长能力使得它们能导致包括尿道感染在内的各种疾病。禽大肠杆菌病是全部或部分由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的局部或全身性感染。与UPEC类似,APEC在禽类也有广泛的致病潜能。基于这种广泛的致病潜能,UPEC和APEC被归为新型致病性大肠杆菌——肠道外病原性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)。由于APEC和UPEC在肠道外感染中可能面临宿主相似的挑战,它们可能具有某些相似的致病基因和致病能力。很多研究证明,APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。本研究在收集本地区UPEC分离株的基础上,探明本地区UPEC的流行病学及其耐药性情况,比较本地区UPEC和APEC分离株的种系发生型、毒力基因型的相似性;选择代表性APEC、UPEC分离株感染实验小鼠和鸡,通过DNA芯片技术和相对定量反转录PCR测定受试毒力基因在体内的表达水平,从而揭示APEC、UPEC毒力基因在同一宿主体内的表达规律,最终为弄清APEC与UPEC是否作为对方毒力基因贮库这一关键问题提供依据。研究结果将加深我们对APEC、UPEC毒力基因的形成、分布、演化规律的理解,强化我们对APEC作为UPEC毒力基因贮库这一推断的认识,为深入研究UTIs和禽大肠杆菌病的致病机理和特异防制措施奠定基础。1.江苏部分地区UPEC分子流行病学与耐药性研究从江苏部分地区尿道感染临床病例中分离、鉴定出202个UPEC分离株。对分离株的血清型、种系发生型、毒力基因型、耐药性以及毒力因子与耐药性间的关系作了研究。分离株最常见的血清型为O1,其它主要血清型还有O6、O7、O15、O18、O26和O25;种系发生型中,D和B2型最为常见,分别占受试分离株的42%和38%,而A和B1型分别占13%和7%。在受检的38个毒力基因中,fimH和feoB的检出率超过90%;50%以上的分离株至少携带papA、papC、papEF、papG、kpsMTⅡ、ompT、iutA、fyuA、traT、irp-2这10个基因中的一种。在黏附素中,P菌毛相关基因检出率仅次于fimH;在保护素中,荚膜形成相关基因kpsMT检出率较高;而三种毒素基因出现的频率相当。分离株耐药性较强,多重耐药现象普遍。在供试的14种抗生素中,UPEC分离株对11种抗生素的耐药率均超过了50%,其中,对萘啶酮酸、氨苄西林和美洛西林的耐药率均达到了90%以上;对磺胺甲基异噁唑的耐药率达到73%,远高于国外报道;对头孢西定、呋喃妥因、氯霉素的敏感性相对较高,其耐药率分别为22%、23%、36%;按美国国家临床实验室标准委员会方法手册,受试的202个UPEC分离株均为多重耐药菌株。表明受检地区UPEC的耐药情况相当严重,供试的抗生素已不适合作为受检地区抗尿道感染临床使用首选药物。本研究结果还表明,头孢噻肟、头孢西定、氯霉素和呋喃妥因抗性菌株,相对于其敏感菌株毒力有下降的趋势,其中呋喃妥因抗性菌株与其毒力下降之间的关系为首次报道。2. APEC与UPEC毒力基因及其在体内外表达差异的比较以我国自行分离的APEC和UPEC菌株为对象,对其血清型、种系发生型、毒力基因型及其毒力基因在体内外表达规律等方面的相似性进行了研究。结果表明二者在血清型、种系发生型、毒力基因型和毒力基因在体内外的表达规律等方面都表现出很大的相似性。本研究中O1和O18血清型为UPEC分离株的优势血清型,而这两种血清型在APEC分离株中也是常见的血清型。UPEC分离株的种系发生型以D和B2型最为常见,分别占受试分离株的42%和38%,其次是A和B1型分别占13%和7%;而APEC分离株以A和B2为主,A型比例最高为42%,B2型次之,为36%,D型和B1型分别为12%和10%。在受检的38个毒力基因中,检出频率最高的两个基因是feoB和fimH,其在两类菌株中的出现频率都超过90%;APEC和UPEC分离株中都检测出许多黏附素相关的基因、铁摄取相关的基因及质粒相关的毒力基因。SPF鸡的LD50测定结果显示UPEC代表菌株U17略低于APEC代表菌株E058,二者差异不明显,且攻毒鸡出现的病变相似。通过DNA芯片,对两种来源的大肠杆菌代表菌株分别在鸡攻毒模型和小鼠尿道感染模型中毒力基因的表达规律进行了研究。在攻毒鸡体内,APEC E058株和UPEC U17株中89%的T测试基因在表达趋势上一致;APEC E058株在攻毒鸡体内表达水平明显上调的5个基因(cvaC、neuC、ompT、iutA和iucCD)中,有两个基因(cvaC和neuC)在UPEC U17株中也明显上调,其它3个基因iutA、iucCD和ompT在UPEC U17株中也表现为上调趋势;APEC E058株在攻毒鸡体内表达水平明显下调的4个基因(aec-30、aes-8、gyrB和mdh),在UPEC U17株中也出现下调趋势。在小鼠体内,APEC E058株与UPEC U17株中82%的T测试基因在表达趋势上一致;UPEC U17株中明显上调的2个基因iucCD、tir和明显下调的2个基因sta、catI在APEC E058株中也表现为相应的上调或下调趋势。应用DNA芯片技术在国际上首次揭示,APEC和UPEC分离株在同一感染模型中的转录子具有相似的表达谱。上述研究结果提示我们,APEC很可能是UPEC的来源或者是UPEC毒力基因的贮存库。同时,许多与铁摄取系统相关的基因在鸡和小鼠体内的表达都表现为上调甚至明显上调,提示我们铁摄取可能是大肠杆菌得以实现其肠道外感染的必备条件。3.检测ompT和ftsk相对定量PCR方法的建立及其对DNA芯片检测ompT表达水平的验证和对ftsk表达水平的解析本研究利用嵌合荧光(SYBR GreenⅠ)标记,以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因,建立了用于ompT和ftsk基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR (real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)。运用该定量PCR分别建立了内参基因gapA和目的基因ompT与ftsk的3个标准曲线,这些标准曲线的斜率和线性关系均符合要求,表明所建立的定量PCR体系的扩增效率高、定量准确。定量PCR对ompT和ftsk基因在感染鸡体内的表达水平的解析结果表明,相对于体外培养,APEC E058株ompT、ftsk在鸡体内的表达分别上调了6.69和23.57倍;UPEC U17株分别上调了6.72和9.21倍。DNA芯片的检测结果表明,在鸡体内APEC E058株ompT的表达上调了2.54倍,证明我们自行研制的DNA芯片的检测结果是可信的,qRT-PCR比DNA芯片检测更为灵敏。上述结果提示我们,ompT和ftsk可能与大肠杆菌对鸡的致病力有关,即它们可能是APEC新的致病基因。4.禽病原性大肠杆菌ftsk基因突变株的构建及其致病性鉴定运用基因重组方法分别将卡那霉素抗性基因(kan)连接到PCR扩增的ftsk两端区域的2个基因片段之间,并分别插入到pBluescriptⅡS K (+) (pBSK)载体的多克隆位点中,构建出带kan基因标志的载体pBSK-F2-Kan-F1,通过PCR扩增F2-Kan-F1片段,电转化入APEC分离株E058中,根据同源重组原理,筛选出APEC E058 ftsk基因缺失突变株E058(?ftsk)。生长曲线测定结果显示,E058(?ftsk)的生长速度低于亲本菌株E058株,动物实验结果表明E058(?ftsk)在攻毒后6、12和24 h时血液、肝脏、脾脏和肺中的细菌数显著少于APEC E058株。APEC E058株感染组在接种48h后,除扑杀鸡外,接种鸡全部死亡;而E058(?ftsk)组相应的死亡率为20%左右。因此,可以认定ftsk为APEC E058株重要的毒力基因。综上所述,对江苏部分地区UPEC的流行病学调查表明,UPEC的常见血清型为O1、O6、O7、O15、O18、O26和O25, D和B2是其最常见的种系发生型,结果与国外报道基本一致。在供试的14种抗生素中,UPEC分离株对11种抗生素的耐药率均超过了50%,其中,对萘啶酮酸、氨苄西林和美洛西林的耐药率均达到了90%以上;对磺胺甲基异噁唑的耐药率达到73%;分离株均为多重耐药菌株,表明本地区UPEC的耐药情况相当严重。UPEC分离株中,头孢噻肟、头孢西定、氯霉素和呋喃妥因抗性菌株,相对于其敏感菌株毒力有下降的趋势,其中呋喃妥因抗性菌株与其毒力下降之间的关系为首次报道。UPEC与APEC毒力因子及毒力基因在体内表达差异的比较结果表明,二者无论是在种系发生型、毒力基因型还是毒力基因在体内的表达规律上都有很大的相似性,提示我们APEC很可能是UPEC的来源或者是UPEC毒力基因的贮存库。通过建立的相对定量反转录PCR,对APEC E058株的ompT和ftsk基因在感染鸡体内的表达水平的解析,验证了DNA芯片的检测结果是可靠的,ompT和ftsk可能是APEC的毒力因子。利用基因重组技术对APEC E058株的ftsk基因进行了突变,测定了突变株的生长速度,并应用动物实验来评价此基因在APEC E058株对人工感染鸡致病性中的作用。结果显示,突变株生长速度低于亲本株,突变株在攻毒鸡的血液、肝脏、脾脏和肺中的细菌数显著少于亲本株,攻毒后48 h内,除扑杀鸡外,亲本株接种组的鸡全部死亡,而突变株组相应的死亡率为20%左右,表明ftsk是APEC的重要毒力基因。